dianas 5(1) > Gallego-Tamayo etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160314

La inhibición de la autofagia aumenta la sensibilidad al cisplatino en células de carcinoma anaplásico de tiroides.

Beatriz Gallego Tamayo^a, Eva María Jiménez Mora, Antonio Chiloeches

Departamento Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud. Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. bgallego28@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: autofagia; cisplatino; tiroides; apoptosis

Resumen

El cáncer de tiroides es el tumor endocrino más común y, aunque es altamente curativo, presenta una elevada tasa de recurrencia [1]. Una de las mutaciones más frecuentes en este tipo de tumores es la sustitución de la Val600 por un glutámico (V600E) en la proteína BRAF. Esta mutación causa una hiperactivación de la vía de las ERK-MAPKs, favoreciendo la proliferación e invasividad tumoral e inhibiendo la muerte celular por apoptosis [2,3]. Sin embargo, las terapias con inhibidores de BRAF no dan los resultados esperados en el tratamiento del cáncer de tiroides, causando importantes efectos adversos de lesiones de la piel asociadas a hiperproliferación, llegando en algunos casos a producirse carcinomas de células escamosas y queratoacantomas en un 15-30% de los pacientes [4]. Debido a esto, se plantea la necesidad de utilizar terapias combinadas para aumentar la efectividad y especificidad del tratamiento en este tipo de cáncer. Por otra parte, la autofagia es un proceso celular por el cual se produce un reciclaje de los componentes celulares, mediante su incorporación a lisosomas a través de la formación de unas vesículas denominadas autofagosomas [5]. Este proceso ha adquirido gran importancia en el estudio del cáncer y se le han atribuido tanto efectos pro-tumorales, ya que actúa como método de defensa frente a situaciones de estrés celular, como antitumorales llevando a la muerte celular por sí misma o mediante apoptosis [6,7]. Además, se ha visto que este proceso catabólico puede ser el causante de ciertas quimiorresistencias en células tumorales [8]. Por todo ello, estudiamos el papel que posee la autofagia en células tumorales tiroideas que presentan la mutación V600EBRAF sobre la viabilidad celular y la respuesta al agente terapéutico Cisplatino. Para ello, analizamos la viabilidad celular y la apoptosis, mediante MTT y citometría de flujo, tras el tratamiento con Cisplatino, en presencia y ausencia de los inhibidores de la autofagia Bafilomicina A1 o 3-metiladenina (3-MA), en la línea celular derivada de un tumor anaplásico tiroideo BHT101. Nuestros resultados indican que la autofagia regula la supervivencia en estas células. Por otra parte, el tratamiento con Cisplatino conlleva una reducción de la viabilidad y un aumento de la muerte celular. Además, mediante experimentos de inmunodetección, observamos que el tratamiento con Cisplatino también modula la autofagia en las células BHT101, al modificar los niveles de la proteína p62 y los de la proteína LC3-II, marcadores del proceso de autofagia. Por último, el tratamiento con Cisplatino junto con la inhibición de la autofagia produce mayores efectos sobre la supervivencia que cada tratamiento por separado. Todos estos datos indican que la autofagia es un proceso modulador de la supervivencia de las células tumorales tiroideas y que el Cisplatino lo altera, Estos datos sugieren que la autofagia puede ser utilizada como una diana terapéutica en los tumores tiroideos con la mutación ^V600EBRAF resistentes a Cisplatino.

1. Migzhao, Xing. 2013. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Rev/Cancer 13:184-99.


2. Kam-Tsun, Tang y Chen Hsen, Lee. 2010. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma: pathogenic role and clinical implicaions. J Chin Med Assoc., 73 (3):113-128.


3. Karasarides M, Chiloeches A, et al. 2004. B-RAF is a therapeutic target in melanoma. Oncogene 23(37): 6292-8.


4. Flaherty, K., Puzanov, et al. 2009. Phase I study of PLX4032: Proof of concept for V600EBRAF mutation as a therapeutic target. J Clin Oncol., 27.


5. Boya P, et al. Emerging regulation and functions of autophagy. 2013. Nat Cell Biol. 15: 713-20.


6. Lin CI, et al. 2009. Autophagy: a new target for advanced papillary thyroid cancer therapy. Sugery, 146: 1208-14.


7. Vucicevic L, Misirkic M, et al. 2011. Compound C induces protective autophagy in cancer cells through AMPK inhibition-independent blockade of Akt/mTOR pathway. Autophagy, 7(1): 40-50.


8. Fukuda T, et al. 2015.The anti-malarial chloroquine suppresses proliferation and overcomes cisplatin resistance of endometrial cancer cells via autophagy inhibition.Gynecol Oncol.137(3):538-45.


9. García-Cano J, Ambroise G, et al. 2015. Exploiting the potential of autophagy in cisplatin therapy: A new strategy to overcome resistance. 20;6 (17):15551-65.

   Cita: Gallego Tamayo, Beatriz; Jiménez Mora, Eva María; Chiloeches, Antonio (2016) La inhibición de la autofagia aumenta la sensibilidad al cisplatino en células de carcinoma anaplásico de tiroides. Actas del I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain). dianas 5 (1): e20160314. ISSN 1886-8746 (electronic) journal.dianas.e20160314 https://dianas.web.uah.es/journal/e20160314. URI http://hdl.handle.net/10017/15181

   Copyright: © Gallego-Tamayo B, Jiménez-Mora EM, Chiloeches A. Algunos derechos reservados. Este es un artículo open-access distribuido bajo los términos de una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

   

dianas 5(1) > Jiménez-Mora etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160315

^V600EBRAF regula el flujo autofágico en células tumorales tiroideas.

Eva María Jiménez Mora, Beatriz Gallego Tamayo, Antonio Chiloeches Gálvez

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871, Madrid.

a. evajmora@yahoo.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: cáncer papilar de tiroides; V600EBRAF; autofagia; LC3; p62; mTOR; AMPk

Resumen

La mutación en el gen de BRAF que codifica para la proteína ^V600EBRAF es una de las alteraciones más comunes en cáncer papilar de tiroides (PTC) [1]. Son muchos los estudios que demuestran que esta mutación aparece en los PTCs más invasivos, agresivos y con mayor capacidad para metastatizar. También se ha demostrado una asociación significativa de esta mutación con la progresión clínica, recurrencia y fallo en el tratamiento de los PTCs [2]. La autofagia es un proceso por el cual la célula recicla moléculas y orgánulos dañados secuestrándolos en vesículas de doble membrana (autofagosomas) y transportándolos para su degradación por fusión con los lisosomas (autofagolisosoma). El aumento de la autofagia puede ser debido a varias causas, entre las que se encuentran la activación de la quinasa AMPK y la inhibición de la quinasa mTOR. Este proceso es importante en la patogénesis de diversas enfermedades, incluido el cáncer. Existen datos que indican que la autofagia está implicada en la iniciación y progresión de cáncer de tiroides, así como, en la resistencia a la terapia, por lo que podría ser utilizada para aplicaciones terapéuticas [3]. Sin embargo, se sabe muy poco sobre el papel que juega la mutación ^V600EBRAF en el proceso de autofagia y su relación con la progresión de PTCs. El objetivo de este trabajo es estudiar la implicación de esta mutación en la autofagia. Para ello, se han empleado las células de cáncer de tiroides 8505C, que poseen la forma oncogénica ^V600EBRAF , y WRO, que contienen la forma silvestre de esta proteína, en las que se han estudiado los niveles de los marcadores autofágicos, p62 y LC3, mediante western blot, así como la localización de este último en autofagosomas o autofagolisosomas, mediante detección de fluorescencia con microscopía confocal. Además, para comprobar la posible implicación de ^V600EBRAF en la autofagia mediada por mTOR y AMPK, se estimaron los niveles de fosforilación de dichas proteínas y de sus sustratos, proteínas S6 y ACC, respectivamente, en ambas líneas. Los resultados obtenidos muestran como, tanto la inhibición de BRAF con el inhibidor PLX 4720, como la eliminación de su expresión mediante siRNA, modifican los niveles de las proteínas p62 y de LC3, marcadores de la autofagia, así como la actividad de mTOR y un aumento de actividad de AMPK. Estos datos se corroboran con la sobreexpresión de ^V600EBRAF en las células WRO, en las que los niveles de p62 y LC3, la actividad de mTOR y la de AMPK, es contraria a la observada cuando se inhibe ^V600EBRAF . Nuestros resultados indican que ^V600EBRAF regula los niveles de los marcadores autofágicos LC3 y p62 en las líneas 8505C y WRO, y que el efecto que tiene sobre la autofagia parece independiente del producido por mTOR y AMPK. Todo esto sugiere que el oncogén BRAF podría ejercer alguna de sus funciones protumorales a través de la modulación de la autofagia celular.

1. Garnett, M.J., Marais, R. 2004. Guilty as charged: BRAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6(4):313-9


2. Xing, M. 2007. BRAF mutation in papillary thyroid cancer: pathogenic role, molecular bases, and clinical implications. Endocr .Rev. 28(7):742-62.


3. Netea-Maier, RT., Klück, V., Plantinga, TS., Smit, JW. 2015. Autophagy in thyroid cancer: present knowledge and future perspectives. Endocrinol (Lausanne). Feb

dianas 5(1) > García-Romero etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160316

Genomic DNA isolated from extracellular vesicles derived from Glioblastoma cells could improve tumor diagnosis and follow-up of patients.

Noemí García-Romero, Josefa Carrión-Navarro, Susana Esteban-Rubio, Marta Alonso, Cristobal Belda-Iniesta, Angel Ayuso-Sacido

1. Fundación de Investigación HM-Hospitales, Madrid.  2. IMDEA-Nanociencia, Madrid.  3. Universidad San Pablo CEU, Madrid.  4. CIMA, Pamplona.

a. noemigromero@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Keywords: Glioblastoma; exosomes; extracellular vesicles, genomic DNA; diagnostic

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common (15% of all brain tumors) and aggressive primary brain tumour. It is classified by the World Health Organization as a type IV glioma, and the average of survival is 15 months after treatment (surgery and quimio-radio therapy). Although great amounts of molecular advances have been made, their translation to the clinic is unfortunately limited. It is known that CICs from GBM produce different types of extracellular vesicles (EVs), which are assorted in apoptotic bodies (1-4μ), shedding microvesicles (200-1000nm) and exosomes (around 60-200nm). The formation and shedding of these EVs have an enormous importance in the intercellular communication. Indeed, it has effects on tumour progression such as metastasis, angiogenesis and hampers immune response. EVs have been shown to carry proteins, different types of RNA (mRNA, miRNA, ncRNA), and some species of DNA, as well as two oncogene sequences (c-Myc and H-ras) and mtDNA. Recent findings from our group show that different type of EVs incorporate in their cargo gDNA sequences from different type of oncogenes, all of them related to the biology of GBM. These sequences, together with RNA sequences, proteins and different type of metabolites, represent a novel approach to improve brain tumour diagnostic, treatment and follow up of patients.

dianas 5(1) > de-Lucio-Ortega etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160321

Implicación del dominio BH3 de Li-BH3AQP en la muerte celular de L. infantum.

Héctor de Lucio Ortega, Carlos Mario Genes Robles, Pedro Sánchez-Murcia, Federico Gago Badenas, Antonio Jiménez-Ruiz

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871, Madrid.

a. hectorln711@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Resumen

La leishmaniasis es una enfermedad grave y muy extendida causada por parásitos del género Leishmania. Recientemente se ha observado la importancia de la muerte celular similar a apoptosis (MCSA) que sufren estos microorganismos, tanto en el proceso de infección como en la progresión de la enfermedad. La apoptosis en eucariotas superiores es un proceso regulado por los miembros de la familia Bcl-2, que hasta la fecha no han sido descritos en tripanosomátidos. Sin embargo, resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que los parásitos del género Leishmania eran capaces de interactuar con Bcl-xL, una proteína humana perteneciente a dicha familia. Por ello, realizamos una búsqueda en el genoma de Leishmania de genes que codificaran proteínas que contuviesen dominios BH3, dominios clave para la función de todos los miembros de la familia Bcl-2. Así identificamos un dominio putativo BH3 en la proteína Li-BH3AQP de L. infantum, que es una acuaporina capaz de interaccionar con la proteína humana Bcl-xL y modular la apoptosis en células HeLa. Además, su sobreexpresión en L. infantum modifica el comportamiento de estos parásitos frente a diversos estímulos de muerte.

dianas 5(1) > Sánchez-Milla etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160322

Efectos de la internalización de la carga positiva de dendrímeros carbosilano catiónicos, en su capacidad como transportadores de ácidos nucleicos y antibacterianos.

María Sánchez-Milla, Elena Fuentes Paniagua, Javier Sánchez-Nieves, Marek Maly, José Luis Copa Patiño, Juan Soliveri de Carranza, Javier de la Mata

1. Departamento de Química Orgánica y Química Inorgánica, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid.  2. Centro de bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), Madrid.  3. Faculty of Science, J. E. Purkinje University, CzechRepublic.  4. Departamento de Biomedicina y Biotecnología, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid.

a. m.sanchezmilla@edu.uah.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: Dendrímeros catiónicos; interiorizar carga; nanoconjugados; VIH; antibacterianos

Resumen

Los dendrímeros son macromoléculas con un tamaño y masa molecular perfectamente definidos y que permiten concentrar un gran número de grupos funcionales en su superficie, lo que les dota de unas propiedades particulares y específicas, que permite su aplicación en diferentes campos, entre ellos y de una forma muy destacada en biomedicina. Dentro de estas aplicaciones, los dendrímeros catiónicos han sido utilizados, por ejemplo en el transporte de ácidos nucleicos para procesos de terapia génica [1] o como agentes antibacterianos [2]. En el primer caso, los dendrímeros forman nanoconjugados con pequeños ARN de interferencia (siARN) protegiéndolos de las enzimas de degradación y ayudando a este material génico a entrar al interior celular. Mientras que en el segundo caso, la carga positiva de estas macromoléculas provoca la desestabilización de las membranas bacterianas, causando la muerte de estas bacterias y por tanto ejerciendo un efecto bactericida [3]. En este trabajo se describe la síntesis de dendrímeros catiónicos, donde la carga positiva ha sido desplazada hacia el interior del esqueleto dendrítico y la superficie se ha funcionalizado con grupos hidróxido para estudiar cómo afecta a la capacidad de transporte de ácidos nucleicos, la capacidad antibacteriana y a la toxicidad de estos sistemas. Para los estudios del transporte de ácidos nucleicos fue elegido el siARN-Nef, el cual es un ARN de interferencia que evitaría de replicación del virus de inmunodeficienca humana(VIH), causante del SIDA [4]. Se eligió este ARN ya que el SIDA es una enfermedad con 35,3 millones de personasinfectadas en todo el mundo, produciéndose en el año 2012 2,3 millones de nuevas infecciones, y 1,6 millones de muertes por causas asociadas a este síndrome. Además los tratamientos actuales no son capaces de eliminar por completo los reservorios virales en el organismo y existe un número elevado de efectos secundarios. Los estudios muestran que el desplazamiento de la carga positiva hacia en interior del esqueleto dendrítico en los nuevos dendrímeros sintetizados les lleva a formar nanoconjugados más lábiles, facilitandosu posterior liberación a lo largo del tiempo, lo que podría permitirque el siARN pudiera realizar la función para la que ha sido diseñado de una manera más eficiente. Los resultados experimentales obtenidos han sido avalados también por un estudio de simulación computacional. Por otro lado, las infecciones bacterianas son una de las principales causas de muerte en la actualidad, fundamentalmente debido a las resistencias que están generando las bacterias a los antibióticos tradicionales, lo que hace necesario el desarrollo de nuevas moléculas con actividad antibacteriana y que no generen resistencias. En este sentido, los dendrímeroscarbosilano catiónicos han mostrado eficacia como agentes antibacterianos de amplio espectro, capaces de eliminar tanto bacterias Gram + como Gram -. Siguiendo está línea de investigación se han probado los nuevos dendrímeros catiónicos sintetizados en este trabajo como agentes antibacterianos, tratando de establecer también el efecto que sobre esta actividad ejerce la interiorización de la carga positiva de estos derivados.

1. de las Cuevas, N., et al. 2012.In vitro studies of water-stable cationic carbosilanedendrimers as delivery vehicles for gene therapy against HIV and hepatocarcinoma. Med. Chem., 19(29): 5052-61.


2. Chanawanno, K., et al. 2010. Synthesis, structure and in vitro antibacterial activities of new hybrid disinfectants quaternary ammonium compounds: pyridinium and quinoliniumstilbenebenzenesulfonates. Eur. J. Med. Chem., 45(9): 4199-208


3. Wang, B., et al. 2010. Inhibition of bacterialgrowthand intramnioticinfectionin a guinea pig model of chorioamnionitis using PANMAN dendrimers. Int. J. Pharm., 395: 298-308.


4. Das A.T., et al. 2004. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition. J Virol. 78(5):2601-5.

dianas 5(1) > García-Pastor etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160323

Producción de micropartículas por células tubulares proximales en ambiente diabético.

Coral García-Pastor, AB Fernández-Martínez, V Moreno-Manzano, FJ Lucio-Cazaña

1. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871, Madrid.  2. Departamento de Biología, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, España.  3. Laboratorio de regeneración neuronal, Centro de investigación Príncipe Felipe, Valencia, España.

a. coral.garcia@edu.uah.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Resumen

La nefropatía diabética (ND) constituye la causa más frecuente de insuficiencia renal crónica terminal siendo fundamental conocer todos los mecanismos implicados en la evolución de la enfermedad. Las células proximales tubulares renales (CPT) contribuyen al desarrollo de fibrosis renal y su exposición crónica a alta glucosa genera muchos de los cambios tubulointersticiales típicos de la ND bien instaurada. De hecho, la degeneración tubular y la fibrosis intersticial son las lesiones que correlacionan mejor con la albuminuria y la progresión de la ND. Las micropartículas (MP) son pequeñas vesículas de diferente origen y tamaño que se presentan como nuevos mecanismos intercelulares de comunicación. Estudios in vivo, han comprobado la existencia de un aumento en la producción de MP en pacientes diabéticos y su relación con complicaciones vasculares (causantes del 50% de las muertes en pacientes diabéticos) por tanto, conocer el mecanismo celular por el que estas MP actúan ayudará a establecer nuevas dianas terapéuticas para prevenir las complicaciones asociadas al desarrollo de la ND. Nuestro trabajo pretende averiguar si las CPT producen MP de forma basal y si al ser sometidas a alta glucosa e hipoxia (situaciones potencialmente susceptibles de producirse en un riñón diabético) se produce una modificación en el número o cantidad de proteína que contienen las MP. Métodos: I) Cultivo de células HK2 en condiciones de hipoxia (1% O2) y/o hiperglucemia (25mM). II) Aislamiento por centrifugaciones sucesivas de MP. III) Caracterización de las MP por distintas técnicas (microscopía electrónica, BCA, nanosight y citometría de flujo). Resultados: Las células HK2 generan MP en situaciones basales, y su producción aumenta significativamente tras someterlas a hipoxia . Sin embargo, la cantidad de proteínas que contienen las MP, solo se ve alterada si, además, las células están sometidas a un incremento de los niveles de glucosa en el medio, situación similar a la que ocurre en un riñón diabético. Discusión: Tanto la hipoxia como la exposición a alta glucosa son dos factores claramente relaciones con la aparición de fibrosis en varias líneas celulares renales. Nuestro trabajo pretendía descubrir si la inducción de este fenotipo fibrótico en CPT, previamente descrito, se debe a un mecanismo mediado por MP. El primer paso para ello era confirmar la existencia de diferencias en la producción de MP (ya fuese en número de MP o en contenido de proteína) en situaciones de hipoxia y alta glucosa como se ha confirmado en el presente trabajo. Basándonos en estos datos, experimentos futuros, intentarán confirmar la aparición de un fenotipo fibrótico en diferentes células tubulares tras añadir MP obtenidas en situaciones de hipoxia y alta glucosa.