{"id":201,"date":"2018-03-01T22:33:13","date_gmt":"2018-03-01T22:33:13","guid":{"rendered":"http:\/\/www3.uah.es\/secuah\/congreso\/comunicacion-secuah-2018-copy-3\/"},"modified":"2018-03-01T22:33:13","modified_gmt":"2018-03-01T22:33:13","slug":"dianas-2018-7-1-e201803b12-bernal-y-roza-inmunohistoquimica-en-ganglios-de-la-raiz-dorsal-transparentes-tras-marcaje-retrogrado-de-neuromas-experimentales-en-raton","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/dianas-2018-7-1-e201803b12-bernal-y-roza-inmunohistoquimica-en-ganglios-de-la-raiz-dorsal-transparentes-tras-marcaje-retrogrado-de-neuromas-experimentales-en-raton\/","title":{"rendered":"dianas 7 (1) Bernal y Roza 2018 Inmunohistoqu\u00edmica en ganglios de la ra\u00edz dorsal transparentes tras marcaje retr\u00f3grado de neuromas experimentales en rat\u00f3n."},"content":{"rendered":"<div class='ad_single_article'>\n<p class='ad_single_article_SO'><a href='https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/dianas-7-1\/#dianas-2018-7-1-e201803b12-bernal-y-roza-inmunohistoquimica-en-ganglios-de-la-raiz-dorsal-transparentes-tras-marcaje-retrogrado-de-neuromas-experimentales-en-raton'>dianas 7(1)<br \/><\/a> &gt; <a href='https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/dianas-2018-7-1-e201803b12-bernal-y-roza-inmunohistoquimica-en-ganglios-de-la-raiz-dorsal-transparentes-tras-marcaje-retrogrado-de-neuromas-experimentales-en-raton\/'>Bernal y Roza<br \/><\/a><\/p>\n\n<p class='signature'>dianas | Vol 7 Num 1 | marzo  2018 | e201803b12<br \/><\/p>\n\n<p class='w_authors ad_single_article_authors'>Laura&nbsp;Bernal<br&nbsp;\/>, Carolina&nbsp;Roza<br&nbsp;\/><\/p>\n\n<p class='w_address ad_single_article_address'>Universidad de Alcal\u00e1. Alcal\u00e1 de Henares, Madrid. Espa\u00f1a.<br \/><\/p>\n\n<p class='w_mail ad_single_article_mail'>laura.bernal@uah.es<br \/><\/p>\n\n<p class='w_meeting ad_single_article_meeting'>III Congreso de Se\u00f1alizaci\u00f3n Celular, SECUAH 2018.<br \/><br \/>\n20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcal\u00e1. Alcal\u00e1 de Henares, Madrid. Espa\u00f1a.<br \/><br \/>\nSesi\u00f3n B1 \u2013 Fisiolog\u00eda<br \/><\/p>\n\n<p class='w_abstract_caption ad_single_article_abstract_caption'>Resumen<\/p>\n<p class='w_abstract ad_single_article_abstract'>La caracterizaci\u00f3n molecular de neuronas axotomizadas se realiza generalmente con inmunohistoqu\u00edmica en secciones congeladas de ganglio de la ra\u00edz dorsal y nervio perif\u00e9rio. Esta t\u00e9cnica es tediosa, larga y lleva a la p\u00e9rdida de informaci\u00f3n. El uso de microscop\u00eda confocal en tejido no-seccionado no es posible debido a la dispersi\u00f3n de la luz, un problema que fue solucionado con el desarrollo de la t\u00e9cnica CLARITY [1]. Desde entonces se han desarrollado numerosos protocolos que tarnsforman tejido intacto en una estructura \u00f3pticamente transparente, que en combinaci\u00f3n con inmunohistoqu\u00edmica y marcaje retr\u00f3grado, permiten la reconstrucci\u00f3n 3D de tractos neuronales. Nos propusimos adaptar el primer protocolo descrito por uno simplificado, pasivo y de precio reducido (inCLARITY) para estudiar el sistema nervioso perif\u00e9rico. Evaluamos su compatibilidad con diferentes marcadores retr\u00f3grados (DiI, Fluoro-gold -FG-, Fluoro-ruby -FR-, Fluoro-emerald -FE- and Retrobeads -RB-) as\u00ed como con inmunohistoqu\u00edmica espec\u00edfica contra nociceptores. En ratones adultos se realiz\u00f3 una cirug\u00eda en la cual se seccionan dos de las tres ramas perif\u00e9ricas del nervio ci\u00e1tico, que fueron luego introducidas en un tubo para evitar la reinervaci\u00f3n. En el extremo cortado se marc\u00f3 con los diferentes marcadores retr\u00f3grados. La incisi\u00f3n se cerr\u00f3. Dos semanas despu\u00e9s los animales fueron perfundidos y el tejido extraido y procesado para cryo-secci\u00f3n (crioprotegido en sacarosa 30% y congelado en OCT) o para transparentaci\u00f3n (embebido en una mezcla de acrilamida\/bisacrilamida\/V-50 durante 4h a 37\u00baC y despu\u00e9s en SDS 8%). En el tejido transparente se realiz\u00f3 inmunohistoqu\u00edmica en free-floating frente a marcadores de nociceptores (IB4 y CGRP) y fibras perif\u00e9ricas (IB4, PanNav). Nuestros resultados muestran como el protocolo implementado (inCLARITY) funciona perfectamente en ganglios de la ra\u00edz dorsal y nervios perif\u00e9ricos en 7-12 d\u00edas, sin producir cambios en volumen o estructura. Adem\u00e1s, todos los marcadores retr\u00f3grados fueron compatibles con esta t\u00e9cnica. Al igual que en las crio-secciones, FG marc\u00f3 muchas c\u00e9lulas, la mayor\u00eda de ellas con citoplasma vacuolado. La tinci\u00f3n de DiI fue pobre para ambos protocolos. FR y FE en crio-secciones solo se visualizaron despu\u00e9s de inmunotinci\u00f3n contra el fluor\u00f3foro, pero ambas se observaron directamente con inCLARITY. RB se observaron bien y con un fondo muy bajo mediante el uso de ambas t\u00e9cnicas. Adem\u00e1s, IB4 y CGRP se observaron claramente en ganglios transparentes. En nervios transparentes, la tinci\u00f3n con IB4 mostr\u00f3 claramente diferencias entre fibras intactas y da\u00f1adas y los nodos de Ranvier se identificaron f\u00e1cilmente con el marcador PanNav. Como conclusi\u00f3n, podemos afirmar que hemos desarrollado con \u00e9xito un nuevo protocolo asequible para todos los laboratorios y que hace transparente tejido nervioso perif\u00e9rico. Adem\u00e1s, este m\u00e9todo presenta varias ventajas en comparaci\u00f3n con el procesamiento tradicional. Hemos demostramos su compatibilidad con cinco trazadores retr\u00f3grados diferentes utilizados com\u00fanmente en el \u00e1rea de la neurobiolog\u00eda. Adem\u00e1s, mostramos c\u00f3mo es posible realizar inmunotinci\u00f3n para fenotipar diferentes poblaciones neuronales. Con respecto a los nervios perif\u00e9ricos, la inmunohistoqu\u00edmica en nervios transparentes permite estudiar los cambios morfol\u00f3gicos y moleculares despu\u00e9s de la axotom\u00eda sin alterar su estructura.<\/p><\/p>\n\n<div class='ad_single_article_citation_box'>\n<\/div>\n\n<\/div>\n\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[5,8,16,18,17,25,29,2],"tags":[],"class_list":["post-201","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-article","category-comunicacion-oral","category-dianas-vol-7-num-1","category-fisiologia","category-secuah-2018","category-sesion-2","category-sesion-b1","category-vols-1-9"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/201","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=201"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/201\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=201"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=201"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/dianas.web.uah.es\/journal\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=201"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}