dianas 5(1) > Muñoz-Moreno etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e201603A5

Efecto beneficioso de los antagonistas de GHRH en la progresion tumoral utilizando un modelo experimental de cáncer de próstata humana.

L Muñoz-Moreno, E Vacas-Oliva, J C Prieto, M J Carmena, A V Schally, A M Bajo

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, España.  2. Veterans Administration Medical Center and Departments of Pathology and Medicine, Division of Oncology and Hematology, University of Miami Miller School of Medicine and South Florida Veterans Affairs Foundation for Research and Education, Miami, FL 33125, USA.

a. laura.munozm@hotmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Resumen

El cáncer de próstata representa el 29% de los nuevos casos de cáncer y la segunda causa de muerte en los hombres. Por ello, se necesitan nuevas opciones terapéuticas entre las cuales podemos encontrar el uso de antagonistas de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH). En el presente trabajo se analiza el efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38, sobre tumores inducidos en ratones inmunodeprimidos con células de cáncer de próstata independiente de andrógenos (PC3). El tratamiento con JMR-132 (10 μg/día) y JV-1-38 (20 μg/día) terminó a los 41 días con una significativa inhibición del crecimiento tumoral. Una vez finalizado el tratamiento se analizaron factores indicativos de un mayor grado de malignidad tumoral mediante ensayos de Western Blot, RT-PCR, inmunohistoquímica y ELISA. Se estudió la expresión de proteínas implicadas en procesos tales como proliferación (PCNA, STAT, p42/44 y PKC), ciclo celular (p53 y Ciclina D1), apoptosis (Bcl2 y Bax), adhesión e invasión (βIG-H3, CD44 y c-myc). En los grupos tratados con los antagonistas se observó una disminución en la expresión de las moléculas moduladoras de proliferación, adhesión e invasión celular. El estudio del ciclo celular reveló un incremento de los niveles de la proteína p53 y una disminución del mRNA para Ciclina D1, indicando una posible parada de ciclo en los grupos tratados con los antagonistas. La expresión de las proteínas Bcl2 y Bax disminuyó y aumentó, respectivamente tras el tratamiento con los antagonistas de GHRH, sugiriendo una posible activación de un proceso apoptótico. En los animales tratados con los antagonistas se evidenció un menor número de focos metastásicos en tejidos blando, óseo y pulmonar. Estos resultados apoyan que el bloqueo de los receptores de GHRH puede modular elementos implicados en la progresión tumoral. Por lo tanto, los antagonistas de GHRH podrían ser considerados como candidatos adecuados para ensayos terapéuticos en el manejo del cáncer de próstata independiente de andrógenos. Este trabajo ha sido llevado a cabo gracias a una ayuda de investigación de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha (PII10-0189-3222) y una beca predoctoral FPU otorgada por la Universidad de Alcalá.

dianas 5(1) > Vallejo-Díaz etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e201603A4

Therapeutic depletion of PIK3R2 for squamous lung cancer.

Jesús Vallejo Díaz, Ariel Ernesto Cariaga, Laura Díaz-Gil, Ana Carrera

Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC). Darwin nº3, 28049, Madrid.

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Resumen

p85α (encoded by the PIK3R1 gene) is the regulatory subunit of phosphoinositide 3-kinase that is usually express at highest levels in normal tissues. In contrast, some tumour types express mainly PIK3R2 (p85β) and reduced levels PIK3R1. We recently showed that increased expression of PIK3R2 correlates with colon and breast carcinoma progression. In this study we analyzed whether ablation of PIK3R2 expression in tumours with increased PIK3R2 expression reduces their growth once established as xenografs in a mouse. For this purpose, we analyzed PIK3R2 expression in squamous cell lung carcinoma lines, a tumour type currently without specific treatment and an ideal model for the planned therapy. We found that squamous cell lung carcinoma lines exhibit increased PIK3R2 and reduced PIK3R1 expression levels. To analyze the effects of reducing PIK3R2 expression, we analyzed the influence of silencing its expression once these tumours are established. Our data show that a significant proportion of the squamous lung cancer cell lines reduced its growth (or disappear) after PIK3R2 depletion. Our current aim is to evaluate which of the proteins that selectively interact with p85β) (and not with p85α) are responsible for its contribution to tumour progression.

dianas 5(1) > de-la-Cueva-Alique etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e201603A3

Nuevos complejos ciclopentadienilo de titanio (IV) con ligandos quirales amino-oxima como potenciales agentes anticancerígenos.

Isabel de la Cueva-Alique, Laura Muñoz-Moreno, Ana María Bajo, Eva Royo

1. Departamento de Química Orgánica y Química Inorgánica, Facultad de Biología, Ciencias Ambientales y Química, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. isabel.cueva@edu.uah.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: Compuestos ciclopentadienilo de titanio; oxima; anticancerígeno; ADN; PC3.

Resumen

La aplicación de los complejos metálicos como fármacos antitumorales comenzó con el descubrimiento de la acción anticancerígena de [PtCl₂(NH₃)₂], conocido como cis-platino y utilizado actualmente en el tratamiento clínico de un buen número de enfermedades tumorales. Debido a los inconvenientes encontrados en cis-platino (desarrollo de resistencias, escasa selectividad), la investigación de nuevos complejos metálicos con propiedades antitumorales mejoradas es especialmente interesante. Durante los últimos años, se han desarrollado y estudiado una gran variedad de especies con potencial acción farmacológica, entre los más importantes, complejos de Ru, Ti y Au, entre otros [1]. En este contexto, es importante destacar el papel de los ligandos unidos al centro metálico, ya que éstos intervienen en la actividad del complejo final. En concreto, los sistemas que poseen grupos oxima (=N-OH) han mostrado interesantes efectos biológicos. Además, su versatilidad en la coordinación al metal de forma mono-, (kN,kO), o di-hapta, (k²NO), puede ayudar a estabilizar el centro metálico en medios fisiológicos. Así, se ha demostrado que complejos de Pt(II), Rh(III) e Ir(III) con ligandos oxima muestran interesantes propiedades antitumorales e interaccionan con el ADN de forma distinta a cis-platino [2,3]. Nosotros presentamos ahora la síntesis y el estudio de una nueva familia de compuestos ciclopentadienilo de titanio que contienen ligandos quirales amonio- o amino-oximato de fórmula general [(ɳ⁵-C₅H₅)Ti(RNH·HCl,NO)Cl₂] (R = Ph1a, Bn1b, 2-pic1c) y [(ɳ⁵-C₅H₅)₂Ti(RNH,NO)Cl)] (R = Ph2a, Bn2b, 2-pic2c). El comportamiento frente a la hidrólisis de estos nuevos complejos metálicos se ha estudiado a diferentes pH mediante espectroscopia de ¹H-RMN. Presentamos también el estudio in vitro de citotoxicidad, adhesión a colágeno y migración celular en la línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógenos PC3. Los derivados 2b y 2c presentan una mayor actividad que la utilización aditiva de sus correspondientes precursores, indicando un efecto sinérgico. La citotoxicidad de 2b y 2c se ha evaluado también en líneas celulares humanas de cáncer renal (Caki-1), cáncer de colon (DLD-1) y cáncer de mama triple negativo (MDA-MB-231) con resultados prometedores. El compuesto 2c presenta cierta selectividad en cáncer renal cuando se compara su actividad en una línea celular no tumoral de riñón (HEK-293T). Los compuestos 2b y 2c favorecen la activación del mecanismo de muerte celular por apoptosis en la línea de cáncer renal Caki-1. Además, se han realizado experimentos de electroforesis en gel para estudiar las interacciones de los nuevos compuestos con ADN de plásmido (pBR322), mostrando que los derivados de Ti(IV) no interaccionan con el ADN o su interacción es muy débil en condiciones fisiológicas.

1. G.N. Kaluderovic, R. Paschke.2011.Anticancer metallotherapeutics in preclinical development.Curr. Med. Chem. 18(31): 4738-4752.


2. S. Wirth, C. J. Rohbogner, M. Cieslak, J. Kazmierczak-Baranska, S. Donevski, B. Nawrot, I. P. Lorenz.2010. Rhodium(III) and iridium(III) complexes with 1,2-naphthoquinone-1-oximate as a bidentate ligand: synthesis, structure, and biological activity. J. Biol. Inorg. Chem. 15(3):429-440.


3. Y. Y. Scaffidi-Domianello, A. A. Legin, M. A. Jakupec, V. B. Arion, V. Y. Kukushkin, M. Galanski,B. K. Keppler. 2011. Inorg. Chem. 50(21):10673-10681.

dianas 5(1) > Lázaro etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e201603A2

Desarrollo de tumores neuroendocrinos tras la desactivación de la familia Retinoblastoma en pulmón de ratón.

Sara Lázaro, Miriam Pérez Crespo, Ana Belén Enguita, Pilar Hernandez, Javier Galindo, Jesús María Paramio, Mirentxu Santos Lafuente

1. Unidad de Oncología Molecular, CIEMAT, Avenida Complutense 40, 28040 Madrid.  2. Servicio de Anatomía Patológica, Hospital 12 de Octubre Avda de Córdoba, s/n. 28041 Madrid.

a. sara.lazaro@ciemat.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: familia retinoblastoma; cáncer de pulmón; DHPN; uretano

Resumen

El cáncer de pulmón es el cáncer con mayor mortalidad a nivel mundial. El 20-25% del total de tumores de pulmón muestra propiedades de células neuroendocrinas (NE).Este tipo de tumores se divide según sus características morfológicas y su grado de proliferación en: Carcinoides Típicos (TC, del inglés typical carcinoid) y Carcinoides Atípicos (AC, del inglés atypical carcinoid) que muestran, respectivamente, un grado bajo e intermedio de proliferación; Carcinomas Microcíticos (SCLC, del inglés small cell lung cáncer) y Carcinomas Neuroendocrinos de Célula Grande (LCNEC, del inglés large cell neuroendocrine carcinoma) de alto grado de proliferación. Los tumores que preceden a las etapas malignas normalmente son nódulos benignos proliferativos de células NE, llamados “tumorlets” [1-2].La familia de proteínas de Retinoblastoma (Rb) tiene un papel fundamental en el control del ciclo celular y está involucrada en la represión de la transcripción y la supresión tumoral [3]. El gen RB1 se encuentra mutado en un 90% de los carcinomas microcíticos humanos [4]. Con el fin de mejorar el conocimiento de la enfermedad, el tratamiento, el diagnóstico y la detección precoz, hemos desarrollado un nuevo modelo de cáncer de pulmón en el cual se delecionan los tres miembros de la familia Rb (Rb1^F/F; Rbl1^-/-; Rbl2^F/F,). La deleción de los genes Rb1 y Rbl2 en las células pulmonares se llevó a cabo por inoculación intratraqueal o instilación intranasal del adenovirus Adeno5-CMV-Cre en ratones Rb1^F/F; Rbl1^-/-; Rbl2^F/F, en adelante ratones TKO. Además, se determinó la susceptibilidad de los ratones TKO a los carcinógenos químicos N-bis(2hidroxipopril)nitrosamina (DHPN) o uretano. Estableciéndose así varios grupos de estudio independientes: ratones sin carcinógeno (control y TKO), ratones tratados con DHPN (control + DHPN y TKO + DHPN) y ratones tratados con uretano (control + uretano y TKO + uretano). La deleción de los tres miembros de la familia Rb, transcurridos de 9 a 24 meses, indujo la aparición espontánea de tumorlets en un 37% de los ratones; estas lesiones mostraban características similares a los tumorlets observados en humanos. Los ratones que, tras la infección, se trataron con DHPN desarrollaron en un 50% de los casos tumores NE, favoreciendo específicamente la aparición de TC. El tiempo de aparición de tumor en los ratones tratados con cualquiera de los dos carcinógenos no fue, en ningún caso, superior a 13 meses desde el inicio del experimento. En relación al tratamiento con el carcinógeno uretano, se observó que todos los animales (tanto infectados como no infectados) desarrollaban tumores NE, principalmente TC y AC. En ausencia de diferencias significativas en el número o el tamaño de los tumores que aparecieron se realizó un análisis del ciclo celular, observándose un aumento de actividad en el grupo infectado con el adenovirus, determinado por un aumento de células positivas para Ki67 e histona H3 fosforilada. La presencia de expresión de p53, p19ARF y p16ink4a en todos los tipos tumorales (tanto espontáneos como inducidos por carcinogénesis) podría explicar, al menos en parte, la ausencia de progresión a tumores de alto grado. Podemos concluir que la inactivación de los tres miembros de la familia Rb en pulmón da lugar a tumores NE de bajo grado. El grado de malignidad aumenta en los tumores desarrollados en ratones tratados con DHPN y uretano sin progresar a los estados más avanzados de la enfermedad. Estos datos sugieren cierta relación entre los miembros de la familia Rb y el desarrollo específico de tumores NE, apuntando a la implicación de otros factores adicionales responsables de la malignización.

1. Travis, W.D. 2009. Lung tumours with neuroendocrine differentiation. Eur J Cancer. 45 Suppl 1: 251-66.


2. Travis, W.D. 2014. Pathology and diagnosis of neuroendocrine tumors: lung neuroendocrine. Thorac Surg Clin. 24(3): 257-66.


3. Viatour, P. and J. Sage. 2011. Newly identified aspects of tumor suppression by RB. Dis Model Mech. 4(5): 581-5


4. Meuwissen R, Berns A. 2005. Mouse models for human lung cancer. Genes Dev.; 19: 643-664

dianas 5(1) > Albarrán etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e201603A1

Cribado mediante un ensayo bioquímico de librerías de compuestos para la identificación de inhibidores de la quinasa CDK8/CICLINA C.

María Isabel Albarrán, Antonio Cebriá, Natasha Zarich, Oliver Renner, Ana Belén García, Sonsoles Rodríguez, Rosario Concepción Riesco, Ana Isabel Hernández, Virginia Rivero, Rosa María Alvarez, Manuel Urbano, Sonia Martínez, Joaquín Paston, Carmen Blanco-Aparicio

CNIO.

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Resumen

Actualmente las estrategias empleadas en la búsqueda de nuevas terapias antitumorales están orientadas y dirigidas hacia una diana concreta mediante la búsqueda de moléculas pequeñas que modulen dianas implicadas en rutas de señalización celular esenciales para la progresión tumoral. El complejo CDK8/CYCLINAC es una quinasa perteneciente a la familia de las quinasas dependientes de ciclinas, que pertenece al grupo de quinasas que fosforilan el dominio C-terminal de la RNA polimerasa II regulando de este modo la transcripción. CDK8/CYCLINAC forma parte del complejo multi-proteico denominado “Mediator”, dentro de este complejo junto con los componentes MED12 and MED13 forman el denominado dominio quinasa que acompleja la acción de factores de transcripción con la maquinaria molecular que lleva a cabo la transcripción La desregulación de la vía Wnt/β-catenina desempeña un papel central en el cáncer de colon y CDK8 ha sido identificado como un oncogén transcripcional en este tipo de tumores, Estudios publicados indican que la sobreexpresión y actividad quinasa de CDK8 podrían ser el desencadenante de la la progresión y agresividad del cáncer colorectal y ser indicador de un mal pronóstico de la enfermedad. Por otra parte también se ha determinado que CDK8 se expresa de manera significativa en adenoma gástrico y su expresión es mayor en adenocarcinoma gástrico. Mediante microarrays se ha correlacionado la expresión CDK8 con baja supervivencia en cáncer de mama y de ovario. Por todo ello, iniciamos un proyecto de desarrollo de fármacos para la identificación y optimización de inhibidores de CDK8/CICLINA C para su posible aplicación terapéutica en cáncer ya sea como agente único o en combinación con terapias existentes. En nuestro proyecto para la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos, desarrollamos y validamos un ensayo bioquímico de “Binding” usando la tecnología “Lanthascreen” para estudiar la actividad quinasa de CDK8/CICLINA C y usarlo para medir la inhibición de la enzima purificada. También se desarrolló un ensayo para evaluar la inhibición celular de CDK8 que mide la modulación de la actividad transcripcional de β-catenina en la línea HCT116 de cáncer de colon que sobrexpresa CDK8. Tras la puesta a punto del ensayo bioquímico, realizamos una campaña de cribado de compuestos químicos, utilizando dos librerías diferentes. En primer lugar se hizo un escrutinio enfocado de 1090 compuestos seleccionados de la librería de 50000 compuestos del CNIO. Este escrutinio se realizó por duplicado a una concentración de 10 M, se estableció un punto de corte del 50% de inhibición y se identificaron 129 compuestos que se confirmaron en ensayos de dosis respuesta, de los cuales 40 compuestos presentaron una IC50 inferior a 0.5 M. Estas moléculas pertenecían a diferentes series químicas con y sin propiedad intelectual y por ello se seleccionaron 5 “hits” para hacer química y generar nuevos moléculas más potentes y con propiedad intelectual. Esta fase de generación de nuevos ”hits” dio lugar a 8 series químicas con propiedad intelectual, que se caracterizaron a nivel de potencia, selectividad frente a otras quinasas (un panel de 24 representantes de las diferentes familias del quinoma) y estudios ADME in vitro como, solubilidad cinética, permeabilidad y estudios de inestabilidad microsómica. En base a todos estos criterios se seleccionó la serie química 5 con la cual en la actualidad estamos en una fase de “hit to lead”. Se realizó una segundo escrutino , esta vez con un objetivo de reposicionamiento y para ello se utilizó una librería de 1539 compuestos procedente de la Johns Hopkins University (JHU) , que contiene fármacos ya aprobados en clínica con diferentes aplicaciones. La campana también se realizó a doble punto y 1 M, se estableció un punto de corte del 70% de inhibición y se seleccionaron 15 compuestos para los que se determinó su IC50 bioquímico y su EC50 en el ensayo celular, pero a pesar de ser potentes bioquímicamente no dieron actividad celular y por ello no se progresaron.

dianas 5(1) > Reventún etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160364

Regulación de ILK en la aterosclerosis.

Paula Reventún, Irene Cuadrado, Marta Saura

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871, Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. reventuntorralba@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: óxido nítrico (NO); quinasa ligada a integrinas (ILK); inflamación; daño vascular; óxido nítrico sintasa inducible

Resumen

La aterosclerosis es una patología multifactorial con un claro componente inflamatorio y que se desarrolla prioritariamente en zonas de desequilibrio hemodinámico. Los cambios de flujo que sufren los vasos se transmiten por la pared vascular gracias a mecanotransductores como las integrinas. Éstas contactan con la Quinasa Ligada a Integrinas (ILK) regulando el tono vasomotor convirtiéndola en diana terapéutica para el tratamiento de la aterosclerosis. Hemos observado que la expresión de ILK está disminuida en arterias ateroscleróticas humanas, coincidiendo con un aumento de la activación de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Así, hipotetizamos que NO producido por la activación de iNOS regula niveles de ILK. Tratando Células Endoteliales de Aorta Murina (MAEC) con la citoquina proinflamatoria TNFα, se activa iNOS y disminuye la expresión de ILK. El tratamiento con un donador de NO produce disminución de ILK tiempo-dosis dependiente que no responde a un defecto transcripcional sino que afecta a la estabilidad de la proteína. El NO disminuye la estabilidad de ILK, promoviendo su ubiquitinación. Sin embargo el proteasoma no interviene en la degradación porque inhibiéndolo farmacológicamente, esta no revierte. Se demuestra que la degradación de ILK inducida por NO se produce en los lisosomas pues ILK y el marcador lisosomal LAMP-1/2 interaccionan, ILK puede visualizarse en los lisosomas y el tratamiento con cloroquina, inhibidor de la actividad lisosomal, revierte los efectos de NO sobre ILK. Concluyendo que NO derivado de iNOS regula los niveles de ILK durante la aterosclerosis favoreciendo su ubiquitinación y posterior degradación por la via de los lisosomas.