Dianas 5(2) > Requena-Triguero etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160901

Aplicaciones quimioinformáticas en el descubrimiento de fármacos.

Carlos Requena Triguero¹, Carlos Roca Magadán², Victor Sebastián Pérez², Nuria E. Campillo Martín^2, a

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Centro de Investigaciones Biológicas-CSIC, C/ Ramiro de Maeztu, 9, 28040 Madrid, Madrid, España.

a. nuria.campillo@csic.es

Palabras clave: quimioinformática; diseño de fármacos; docking; GSK-3β; PDE8

Resumen

La quimioinformática ha sufrido un crecimiento exponencial en los últimos años y ha cambiado la forma en la que se conduce la investigación química, proporcionando un acceso a la información insostenible para los métodos tradicionales. Está basada en aproximaciones computacionales al ligando (métodos indirectos) o a la diana (métodos directos), que constituyen el centro de lo que se conoce como cribado virtual. Las aplicaciones que tienen estas técnicas en el descubrimiento de fármacos, son muchas y variadas, y han conseguido pasar de un proceso poco eficiente a un proceso conocido como desarrollo de fármacos de forma racional, en el que se ahorra mucho tiempo y dinero. Este trabajo pretende la búsqueda, mediante técnicas computacionales, de soluciones en diferentes etapas del desarrollo de un fármaco. El estudio se centra en la búsqueda de nuevos sitios de unión para el desarrollo de un fármaco frente a la diana GSK-3β de Leishmania y en la búsqueda del modo de unión de diferentes compuestos frente a la enzima PDE8, para poder desarrollar inhibidores más selectivos.

Dianas 5(2) > de-la-Usada-Molinero etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160902

LRRK2 como nueva diana terapéutica en retinosis pigmentaria.

Eduardo de la Usada Molinero, Josefa Zaldívar Diez de Bonilla, Loreto Martínez González, Ana Martínez Gil

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Grupo de Química Médica y Biológica traslacional, Departamento de Biología Físico-Química, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, 28040 Madrid, Madrid, España.

a. ana.martinez@csic.es

Palabras clave: retinosis pigmentaria; LRRK2; neurogénesis; microglía; retina neural

Resumen

La retinosis pigmentaria (RP) es un grupo heterogéneo de distrofias retinianas causado por mutaciones en múltiples genes. La RP cursa con disfunción y muerte progresiva de fotorreceptores, lo que causa una pérdida de visión cada vez mayor que termina con ceguera la mayoría de los casos. La enzima leucine- rich repeat kinase 2 (LRRK2) está implicada en procesos tanto inflamatorios como de muerte celular asociados a diferentes patologías neurodegenerativas, y por ello sus inhibidores son una buena estrategia terapéutica para el tratamiento de las mismas, sobre todo para la enfermedad de Parkinson. Dado que la retina neural puede considerarse la parte más externa del sistema nervioso central, en este trabajo se recogen los primeros datos que muestran la presencia de LRRK2 en un modelo de RP por qPCR, pudiendo ser considerada como una nueva diana terapéutica para el tratamiento de esta patología. Con el fin de buscar potenciales agentes terapéuticos para RP, hemos realizado estudios in vivo con un inhibidor de LRRK2. Este compuesto se administró sistemáticamente mediante inyección intraperitoneal a ratones rd10, modelo de RP, a partir del día postnatal 15 y durante diez días consecutivos para estudiar su potencial efecto neuroprotector, sobre la estructura e integridad de la retina, y su efecto antiinflamatorio analizando la localización de la microglía mediante inmunohistoquímica de criosecciones de retina de estos animales. La administración del compuesto parece atenuar la pérdida de fotorreceptores y la migración de la microglía, lo que podría preservar la capacidad visual y disminuir la inflamación que acompañan a la patología en ratones rd10. Nuestros resultados parecen mostrar un efecto neuroprotector de los fármacos inhibidores de LRRK2 en RP e indican el importante papel que puede tener este grupo de compuestos, y en especial SGP1.4, un derivado de isatina utilizado en este estudio, en un futuro tratamiento para esta patología.

Dianas 5(2) > Torres-Valle y Pérez

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160903

Análisis crítico de ensayos clínicos oncológicos.

Lorena Torres Valle, María Isabel Pérez

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. CABYC S.L.

a. lortorval@hotmail.com

Palabras clave: ensayos clínicos; monitor de ensayos clínicos; mieloma múltiple; claritromicina

Resumen

Los ensayos clínicos son la respuesta científica a la necesidad ética de garantizar la eficacia y la seguridad de los nuevos medicamentos. Proporcionan un método controlado, objetivo y reproducible para medir los efectos de un tratamiento sobre la salud. Los ensayos clínicos han evolucionado, tanto metodológica como éticamente, hasta convertirse en procesos muy estructurados, estrictamente reglamentados y profesionalizados en ambos aspectos. En España el Real Decreto 1090/2015, por el que se regulan los ensayos clínicos con medicamentos, establece la obligación de aplicar las normas de Buenas Prácticas Clínicas a la planificación, realización, registro y comunicación de los ensayos clínicos que se realicen en España. En el campo de la oncología, el incremento de la investigación básica y clínica ha permitido grandes avances en el tratamiento contra el cáncer. Actualmente se están realizando numerosos ensayos clínicos en este campo. Uno de los más prometedores es un ensayo fase III, realizado en España y Estados Unidos, que pretende demostrar la eficacia del tratamiento combinado de claritromicina junto con lenalidomida y dexametasona en pacientes con mieloma múltiple. Este ensayo se basa en los prometedores resultados de la fase II, que obtuvo respuestas profundas y significativas con un 90,3% de respuesta objetiva y una tasa de respuesta completa del 38,9%.

Dianas 5(2) > Martín-Díaz etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160904

Generación de un alelo knockout del gen Has1 mediante CRISPR/Cas9 en un modelo de ratón de adenocarcinoma pancreático ductal.

Laura Martín Díaz, Carmen Guerra, Mariano Barbacid

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, 28029 Madrid, España.

a. laura.martind@edu.uah.es

Palabras clave: estroma tumoral; CAFs; CRISPR/Cas9; Has1; PDAC

Resumen

El adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC) es un tipo de cáncer que destaca por su letalidad y frente al cual no existe aún una terapia efectiva. La detección del PDAC suele ser en etapas tardías, donde su agresividad es máxima y los quimioterapéuticos no funcionan. Por lo que se hace patente la búsqueda de nuevas aproximaciones terapéuticas. El PDAC destaca por tener un estroma desmoplásico denso, compuesto en su mayoría de matriz extracelular y células, que van a provocar la fibrosis y la pobre vascularización característica de este tipo de tumor. El estroma no sólo representa una barrera física sino que a su vez interacciona con las células tumorales influyendo en su comportamiento. Los fibroblastos (CAFs) son las células estromales mayoritarias, responsables de producir la extensa matriz extracelular. Nuestro laboratorio ha comparado el patrón de expresión de los CAFs y los fibroblastos pancreáticos normales y ha observado varios genes sobreexpresados en los CAFs. Uno de ellos es la sintasa de ácido hialurónico 1 (Has1). Varios estudios han revelado que el ácido hialurónico tiene un papel importante en el progreso tumoral y en la resistencia a los tratamientos. El objetivo del presente trabajo es la generación de una línea de ratón de PDAC con un alelo knockout para el gen Has1 mediante la tecnología CRISPR/Cas9 por microinyección en embriones de un modelo de ratón de PDAC. Las modificaciones en el alelo de Has1 de los 9 ratones generados se identificaron mediante el ensayo T7 endonucleasa y secuenciación de Sanger. Finalmente de esos 9 ratones se ha observado que 5 de ellos presentan uno o dos eventos de mutación, concretamente deleciones; y que 2 de ellos transmiten germinalmente las mutaciones. La línea de ratón seleccionada se expandirá y cruzará para conseguir la mutación en homocigosis y poder así estudiar el papel de Has1 en el progreso tumoral de PDAC.

Dianas 5(2) > Lin etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160905

Diseño y elaboración del acondicionador capilar RF.

Wanqing Lin, Alicia López García, Sonia González Cenisergue

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Rueda Farma S.L. 28850 Torrejón de Ardoz, Madrid, España.

a. linarbol729@gmail.com

Resumen

Este artículo va a mostrar los procesos de elaborar un acondicionador capilar. Para producir un producto cosmético seguro y eficaz, primero hay que tener en cuenta que el producto debe obedecer las normas y que cumpla las funciones reivindicadas. Antes de poner en fabricación, necesita determinar el método de fabricación de acuerdo con las propiedades y características de las materias primas. Para realizar la puesta en el mercado del producto, hay que finalizar el expediente, comprobando que el dicho producto tenga efectos reivindicados y sea seguro para los consumidores.

Dianas 5(2) > Gargantilla-López etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160906

Síntesis y evaluación de compuestos con actividad antitumoral derivados de nuevos activadores de AMPK.

Marta Gargantilla López, Sergio Quesada Sánchez, Ana Castro Morera

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Instituto de Química Médica, IQM-CSIC. Juan de la Cierva, 3. 28006, Madrid, España.

a. marta.gargantilla@hotmail.com

Palabras clave: oxoindol; antitumorales; cáncer; reprogramación metabólica

Resumen

Además del componente genético, el cáncer se entiende como una enfermedad con un componente metabólico clave a tener en cuenta para poder entender su aparición y su progresión. Las células tumorales pueden sufrir una reprogramación metabólica para adaptarse a las condiciones ambientales en las que se encuentren y no ver afectada su proliferación. Incidir en el equilibrio del metabolismo energético de las células tumorales, alterando farmacológicamente esta capacidad de reprogramación, puede suponer una potente vía para ralentizar su proliferación o incluso ocasionar su muerte. En este sentido, existen fármacos antitumorales cuyos mecanismos de acción están contrastados y consisten en alterar la homeostasis energética de las células proliferativas. Partiendo de las estructuras químicas definidas de estos compuestos, y de prototipos derivados de las mismos, en este trabajo se ha llevado a cabo la búsqueda de estructuras novedosas que puedan tener un efecto antitumoral. A partir de este prototipo se han obtenido compuestos derivados del mismo con una estructura basada en el núcleo de 2-oxoindol en tres pasos de síntesis. Los resultados de este estudio exploratorio han permitido optimizar el rendimiento de reacciones de fluoración, que suponen el último paso de la ruta sintética diseñada, llevando a cabo un estudio exhaustivo de las condiciones experimentales. Además, los ensayos de viabilidad celular incubando diferentes líneas celulares tumorales humanas con los nuevos compuestos obtenidos, ha permitido evaluar el efecto antiproliferativo de los compuestos. La estrecha relación estructural de los nuevos prototipos antitumorales con activadores de AMPK podrían aventurar un mecanismo de acción similar.

Dianas 5(2) > García-Soriano etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160907

Puesta a punto de ensayos de cuantificación de dimerización y actividad de la superóxido dismutasa de hierro A de Leishmania infantum

Juan Carlos García Soriano, Héctor Elessar de Lucio Ortega, Antonio Jiménez Ruíz

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. antonio.jimenez@uah.es

Palabras clave: Leishmania infantum; superóxido dismutasa; actividad; dimerización; citocromo c; ELISA.

Resumen

Los parásitos del género Leishmania son los agentes causales de la leishmaniasis. Estos parásitos tienen la capacidad de sobrevivir dentro de las vacuolas fagocíticas de los macrófagos a pesar de las condiciones de pH y estrés oxidativo allí generadas. Esta resistencia se debe a diversos mecanismos biológicos que comprenden enzimas de detoxificación de las especies reactivas de oxígeno, entre otras. Estas enzimas son potenciales dianas terapéuticas para el tratamiento de la leishmaniasis. Una de estas enzimas es la superóxido dismutasa que cataliza la dismutación del anión superóxido, una especie reactiva de oxígeno con capacidad de originar otras especies reactivas más tóxicas. Leishmania cuenta con 4 superóxido dismutasas de hierro. La superóxido dismutasa de hierro A (Fe-SODA) se localiza en la mitocondria, lugar de producción endógena de superóxido. Se ha visto que la Fe-SODA se sobrexpresa en las formas parasitarias que infectan los macrófagos y que protege de la muerte celular inducida por el tratamiento con miltefosina. En este trabajo se ha clonado, expresado y purificado la Fe-SODA de Leishmania infantum con dos “etiquetas” (tags) moleculares distintas que permiten generar una versión heterodimérica para la puesta a punto de dos ensayos que permitan evaluar la eficacia de compuestos dirigidos contra la enzima. Uno de los ensayos que se ha optimizado en este trabajo ha sido un ensayo de cuantificación de la dimerización basado en la técnica ELISA usando anticuerpos contra las dos etiquetas del heterodímero, uno para pegar a la placa y el otro para evaluar el porcentaje de enzima dimérica. El segundo ensayo está dirigido a medir la actividad catalítica de la enzima. El ensayo de actividad se basa en la producción de superóxido por el sistema xantina/xantina oxidasa y en la competencia por el superóxido entre la Fe-SODA y el citocromo c, una proteína que cambia de color al reducirse por el superóxido.

Dianas 5(2) > Fernández-García etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160908

Puesta a punto y utilización de Leishmania tarentolae como sistema de expresión de proteínas para su posterior purificación y cristalización. Aplicación a la proteína LiEndoG.

Fernando Fernández García, Cristina Oliva Correia, Antonio Jiménez Ruiz

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. fernandofdezgar@gmail.com

Palabras clave: Leishmania tarentolae; Endonucleasa G; LiEndoG; purificación de proteínas

Resumen

La leishmaniosis es considerara por la Organización Mundial de la Salud como una enfermedad desatendida al afectar principalmente a personas en situación de pobreza y con unas condiciones higiénico-sanitarias deficientes, ocasionando entre 20000 y 30000 muertes anuales. Los tratamientos disponibles son escasos y pueden presentar graves efectos adversos, a lo que se suma la aparición de resistencias y la ausencia de vacunas eficaces. Es por ello que el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y compuestos activos es esencial en la lucha contra la enfermedad. Nuestro laboratorio ha identificado que la endonucleasa G de Leishmania infantum (LiEndoG) es vital para el parásito, participando en el proceso de muerte celular programada y jugando un papel dual provida/promuerte. La cristalización de LiEndoG sería muy conveniente para conocer su estructura en detalle y diseñar inhibidores proteicos útiles en terapéutica. Anteriormente se intentó purificar LiEndoG utilizando Escherichia coli como sistema de expresión proteica. Sin embargo, para su obtención se requirieron condiciones desnaturalizantes y una posterior renaturalización, lo que podría ocasionar plegamientos incorrectos y pérdida de actividad enzimática. Es por esto que en este trabajo nos propusimos emplear Leishmania tarentolae como sistema inducible de expresión proteica eucariota por presentar características únicas como introducción de modificaciones postraduccionales o procesamiento de péptidos señal. Con este fin, se diseñaron dos construcciones capaces de integrarse en el genoma de L. tarentolae que, por la adición de tetraciclina al medio, dieran lugar a la expresión de una LiEndoG citoplasmática o secretada, respectivamente. Nuestros resultados demuestran que la utilización de L. tarentolae como sistema de expresión proteica nos permite obtener y purificar una LiEndoG recombinante en condiciones nativas que mantiene su actividad enzimática, mostrando que este método de purificación es mucho más conveniente que el empleado anteriormente en E. coli, si bien aún es necesario más trabajo para optimizar la purificación.

Dianas 5(2) > Carrión-Marchante etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160909

Estudio de la estabilidad de aptámeros generados frente a la proteína 4E-BP1.

Rebeca Carrión Marchante, Ana García Sacristán, Celia Pinto Díez, María Elena Martín, Víctor M. González

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid.  2. Departamento de Bioquímica-Investigación, Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS, 28034, Madrid, España.

a. rebecacm93@gmail.com

Palabras clave: aptámero; cáncer; estabilidad; SELEX; terapia; 4E-BP1

Resumen

El control de la síntesis de proteínas juega un papel importante en el crecimiento y proliferación celular. En la mayoría de los organismos eucariotas se lleva a cabo una traducción dependiente de cap en la cual el factor eucariótico de iniciación (eIF) 4E juega un papel muy importante. La actividad de este factor está regulada por la proteína 4E-BP1 (proteína de unión a eIF4E), entre otras, cuya fosforilación permite la liberación del factor y su participación en la traducción. La sobreexpresión del factor eIF4E produce irregularidades en el ciclo celular relacionadas con el cáncer, enfermedad que produce 8.2 millones de muertes anuales en el mundo. La actividad reguladora de la proteína 4E-BP1 la convierte en una posible diana terapéutica, por lo que en el laboratorio se seleccionaron tres aptámeros frente a dicha proteína a través del método SELEX. Los aptámeros se conocen como 1R, 1F y 20F y poseen estructuras secundarias complejas y con posibilidad de formación de G-cuádruplex, lo que les confiere una alta estabilidad. Por ello en el presente trabajo se ha ampliado la caracterización estructural y funcional de estos aptámeros mediante parámetros como susceptibilidad a nucleasas, IC50, niveles intracelulares, efecto sobre la síntesis de proteínas y constante de disociación. Los resultados posicionan a los aptámeros 1R y 20F como los más estables y los principales candidatos como potenciales herramientas terapéuticas. Sin embargo, es necesario realizar nuevos experimentos funcionales así como estudiar la especificidad de los aptámeros frente a otras proteínas y otros aspectos importantes para su aplicación clínica.