dianas 9(1) > López-Gutiérrez etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003e07

Nuevo método de evaluación in vitro de la actividad Tripanotión Sintetasa de Leishmania infantum para la búsqueda de posibles moléculas inhibidoras

Celia López Gutiérrez^a, Juan Carlos García Soriano, Antonio Jiménez Ruiz

Universidad de Alcalá. Departamento de Biología de Sistemas.

a. celialogu@hotmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad causada por protozoo del género Leishmania y es transmitida al ser humano por la picadura de hembras de flebótomo o moscas de la arena. Como mecanismo de defensa del hospedador, los macrófagos del sistema inmune fagocitan los parásitos y producen especies reactivas de oxígeno (ROS) para eliminar la infección. Sin embargo, los parásitos de Leishmania pueden sobrevivir a este estrés oxidativo mediante un metabolismo redox basado en tripanotión, una molécula que consiste en dos moléculas de glutatión unidas covalentemente a un puente de espermidina. Este sistema es único y diferente del sistema a base de glutatión presente en el resto de eucariotas. Por esta razón, las enzimas involucradas en el metabolismo del tripanotión son candidatos para el desarrollo de fármacos selectivos contra la leishmaniasis. La Tripanotión Sintetasa (TryS) es una de las proteínas más importantes de este sistema, ya que cataliza la síntesis de tripanotión. A diferencia de otras enzimas que participan en el metabolismo del tripanotión, no existe ninguna enzima equivalente en los vertebrados, por lo que no se espera que los fármacos contra la enzima TryS sean tóxicos para el ser humano. El primer paso en el proceso de desarrollo de una molécula inhibidora para esta enzima consiste en generar un método adecuado para evaluar su actividad sintetasa en presencia de distintos candidatos. En este estudio, se obtuvo TryS recombinante en una versión soluble, pura y activa. Se desarrolló un nuevo método para la detección de su actividad basado en una reacción acoplada con la enzima Tripanotión Reductasa. De esta manera, será posible llevar a cabo la detección de una variedad de nuevas moléculas para encontrar un posible inhibidor de TryS.

dianas 9(1) > Bravo-García etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003e06

Estudio del papel pro-vida de la enzima LiEndoG y valoración de su potencial como diana frente al parásito Leishmania infantum

Ana Bravo García, Celia López Gutiérrez, Federico Gago Badenas, Antonio Jiménez Ruiz

Universidad de Alcalá. Facultad de Medicina.

a. ana.bravog@uah.es

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Resumen

El parásito Leishmania infantum es el causante de la leishmaniasis visceral, una enfermedad mortal si no es tratada que afecta a unas 300.000 personas cada año alrededor del mundo. Hasta la fecha, se han valorado numerosas dianas para tratar esta enfermedad, como son las enzimas tripanotión reductasa, superóxido dismutasa o endonucleasa G (LiEndoG), esenciales para la vida del parásito. LiEndoG es una nucleasa codificada en el núcleo que es transportada a la mitocondria gracias a un péptido señal en su extremo N-terminal. Allí se encuentra compartimentalizada hasta que se produce una señal de muerte, momento en el cual, vuelve al núcleo para participar en el proceso de degradación del ADN genómico. Además de su papel en el proceso de muerte celular programada, se ha podido comprobar que LiEndoG es una enzima clave para la proliferación de los promastigotes (conformación del parásito en el vector de la enfermedad) y su posterior infección a macrófagos. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual LiEndoG influye en la viabilidad de estos procesos. Estudios previos en enzimas de la familia de LiEndoG han demostrado que este tipo de enzimas están implicadas en la replicación, reparación y expresión del ADN mitocondrial (mtADN). El ADN mitocondrial en los tripanosomátidos se encuentra compactado en una estructura denominada kinetoplasto, formada por unos pocos maxicírculos y miles de pequeños minicículos de ADN. En los maxicírculos se codifican numerosas proteínas implicadas en la cadena transportadora de electrones, mientras que los minicírculos dan lugar a sgRNAs. Los sgRNAs son los encargados de guiar en la edición del mRNA de esas proteínas mitocondriales, proceso muy característico en este tipo de parásitos. El estudio de la estructura de LiEndoG, que nos recuerda a las Flap-endonucleasas, nos hace pensar que también podría estar implicada en este proceso de edición genética. Tras conseguir eliminar las copias del gen que codifica para LiEndoG por la técnica CRISPR, hemos evaluado el funcionamiento de la respiración mitocondrial midiendo la producción de especies reactivas de oxígeno de los promastigotes gracias a la sonda dihidroetidio (DHE). Efectivamente, hemos podido comprobar como la ausencia de LiEndoG produce un claro aumento de ROS, probablemente asociado a un funcionamiento aberrante de la cadena transportadora de electrones. Esta carencia de respiración mitocondrial funcional podría ser relevante en la diferenciación de los promastigotes a amastigotes y su posterior infección a macrófagos, haciendo de LiEndoG una potencial diana para el tratamiento de la leishmaniasis visceral.

dianas 9(1) > Alcón-Calderón etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003e05

Terapia génica contra la insensibilidad congénita al dolor con anhidrosis (comunicación).

María Mercedes Alcón Calderón, Alvaro Antolínez Fernández, Cristina García Fernández

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares (Madrid).

a. andrecris19971997@gmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: CIPA; TrkA: nociceptores; NTRK1

Resumen

La insensibilidad congénita al dolor, que se denomina también neuropatía hereditaria sensorial y autonómica, es una enfermedad hereditaria poco frecuente que se caracteriza por una disfunción sensorial y autonómica en la que se produce una insensibilidad al dolor. Centrándonos en lo que ocurre molecularmente en la enfermedad, la CIPA está caracterizada por una mutación genética en el NTRK1 que conlleva a una alteración en la función del receptor TrkA al que codifica. Este receptor está implicado en la supervivencia de células nerviosas, en la diferenciación de nociceptores e interviene en el procesamiento del dolor. Por tanto, la unión de este receptor con su ligando transmite señales a la célula para la división de las mismas y la supervivencia. La estrategia a seguir en el trabajo va a ser realizar un modelo animal, en nuestro caso, ratones, en el que a partir de una línea sana vamos a generar ratones que desarrollan insensibilidad congénita al dolor en la etapa embrionaria, manifestándose la enfermedad nada más nacer. Para ello, vamos a realizar ensayos de genética reversa, en los que conocemos el gen sano, vamos a producir una mutación en este gen para luego poder estudiar el fenotipo del ratón que ha sido modificado, utilizando la recombinación homóloga para buscar el mutante de inserción en el gen de interés. Una vez estabilizada la línea de heterocigotos de los cuales podemos obtener ratones con CIPA mediante cruzamientos, vamos a realizar terapia génica con el fin de intentar remplazar el exón 10 mutado que produce la enfermedad por el exón wildtype, y así poder revertir la enfermedad en la etapa embrionaria. Por tanto, el diseño va dirigido a una edición genética en embriones de ratón. Para ello, vamos a realizar la técnica de CRISPR. Al tratarse de una enfermedad autosómica recesiva pensamos en realizar un diagnostico de portadores con el fin de aconsejar y dar a conocer a las personas su situación particular para intentar prevenir la enfermedad en generaciones futuras: para ello, realizamos el método de secuenciación Illumina. También vimos que esta enfermedad lleva asociada otras enfermedades o molestias, como consolidaciones malas de fracturas o retraso mental asociado por lo que proponemos posibles terapias y tratamientos para intentar solucionarlas. En cuanto a pruebas para comprobar el tratamiento propuesto en este trabajo pensamos en realizar 3 experimentos "in vitro" basados principalmente en la metodología del western-blot y citometría de flujo, dejando la puerta abierta a posibles terapias futuras con el fin de intentar mejorar la calidad de vida de estas personas.

dianas 9(1) > Guerrero-Amelín etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003e04

Theorical study for the treatment of Alzheimer’s disease with combined therapy: development and innovation.

Carolina Guerrero-Amelín, Samuel Takvor, Jesús Frutos, Víctor Lombardo

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares (Madrid).

a. carolina.guerreroa@edu.uah.es  b. stm.97@hotmail.com  c. jefrudi@hotmail.es  d. victorlombardo20@gmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Keywords: High Throughput Screening; Alzheimer’s Neurodegenerative Disease; Pharmacological development; Combined therapy; RTN-3

Abstract

Neurodegenerative diseases pose a big problem globally, with no effective treatments for their treatment. These diseases are usually linked to age, being one of the main risk factors for them. Every time we find a more globally aged population thanks to advances in Medicine, and the prevalence of these pathologies increases at an exorbitant rate. One of the main diseases within this group is Alzheimer's. This pathology implies a great social (due to the incapacity it produces) and health (due to the care and treatment of these patients) cost and some authors consider it the great pandemic of the 21st century (with 5-7 million new cases per year and 44 million people affected). Alzheimer's disease affects the CNS, characterized by the loss of synapses and memory progressively. However, the biggest problem today is that there are no techniques that help us with early diagnosis and its etiology is unknown. Although numerous hypotheses have been raised to explain its origin (highlighting the Tau, amyloid and cholinergic hypothesis), none of them has been able to explain the real etiopathogenesis of the disease. After an exhaustive study of the signaling pathways and routes involved in Alzheimer's disease, our group has decided, in a completely new way, to address the treatment of this disease from two different points, carrying out a theoretical study of the result of the combined therapy and presenting the experimental design to follow for the development of a new drug that helps these patients. Our strategy is the design of peptides analogous to reticulon 3 (RTN-3), which is a little studied protein whose function is beta-secretase binding (BACE-1, responsible for the formation of amyloid plaques that damage the neuronal tissue and which is counted overexpressed in this pathology) and inhibit it. The other protagonist of the combination therapy is a GSK-3B inhibitor molecule in a non-competitive ATP form (enzyme causing phosphorylation of Tau and its aggregation, forming the characteristic neurofibrillary tangles of Alzheimer's). Our work shows in detail the screening process (High Throughput Screening) to be followed, with all the techniques to be used, for the development of the peptide analogous to RTN-3, in a totally scientific, documented and analyzed way after reviewing the literature, applying Cellular, molecular and animal biology techniques, presenting the expected results in a theoretical way, and showing the process of selecting cell lines, animal models, techniques, instruments and molecules truthfully and totally analogous to reality.

dianas 9(1) > San-Isidro etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003e03

Study of utility of liposomes in drug delivery.

Elisa San Isidro, Elena de la Torre-Rubio, Judith Recio, Alberto Cook

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares (Madrid).

a. elisasanisidro@gmail.com  b. delatorrerubio.elena@gmail.com  c. judithrecio1997@gmail.com  d. mcooky_8@hotmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Keywords: EVAC, Liposomas, análogo sintético, RUNX2, miRNA, aptámero

Abstract

Liposomes are known to be goodsynthetic vesicles making up by a lipidbilayer that create a hidrophilicenviroment inside. The composition of this bilayer can be design and modifychemically to enhance its stability and functionality. It could be use in medicine as driving vehicles and theycan transport polar drugs inside themthat could insert easily into cells byendocytosis. Herein, we pretend to make a theoretical study of directedtherapy using liposomes with aptamersbinding to the layer to directspecifically to target cells. We havecombined a synthetic analogue of theligand of our therapeutic target in itssurface rising the specificity of liposomes. This synthetic analogue waschosen by a HTS essay using a molecular modeling software where wehave changed diferents aminoacids of the ligand in order to increase theaffinity to its receptor and block thesignaling pahtway. Furthermore, weaim for the liposome to take a miRNAas a drug, developing a novel treatmentfor Calcific Aortic Valve Desease (CAVD).

dianas 9(1) > San-Isidro etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003e02

Theoretical design of combined therapy with BMPR inhibitor and RUNX-2 miRNA in the CAVD.

Elisa San Isidro, Elena de la Torre, Judith Recio, Alberto Cook

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares (Madrid).

a. elisasanisidro@gmail.com  b. delatorrerubio.elena@gmail.com  c. judithrecio1997@gmail.com  d. mcooky_8@hotmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: CAVD; Liposome; BMP2; RUNX-2; miRNA; peptidomimetic

Resumen

La enfermedad de la válvula aórtica calcificada (EVAC) es una enfermedad caracterizada por la diferenciación de las células intersticiales de la válvula hacia un fenotipo pre-osteoblástico. Esta diferenciación celular produce una matriz calcificada, causando de esta forma un remodelaje tisular que conlleva a la estenosis aórtica y a una pérdida de la funcionalidad. Nuestro proyecto se enfoca en evitar la diferenciación osteoblástica inhibiendo la cascada de señalización de BMP2 y el factor de transcripción RUNX-2. Para ello planteamos el siguiente diseño teórico de la investigación que se realizaría para llevar a cabo el descubrimiento de 2 posibles fármacos empleados sinérgicamente en una terapia combinada.

dianas 9(1) > Carrasco-Rubio etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003e01

Estudio teórico de SFRP1 como nueva diana terapéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (comunicación).

Laura Carrasco-Rubio, Eulalia González-Carrion, Javier Martínez-del-Río, Irene Martínez-Pasabados

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares (Madrid).

a. lauralcr20@hotmail.com; lcrlaura20@gmail.com  b. laligonzalezc16@gmail.com  c. javier.mzdr@gmail.com  d. martinezpasabadosirene@gmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Abstract

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso central caracterizada por una muerte progresiva neuronal que afecta principalmente a regiones corticales del cerebro y parte del sistema límbico. Se producen alteraciones en la memoria, el lenguaje, la percepción, la orientación y las funciones ejecutivas, siendo una de las principales causas de demencia en el mundo. Una de las principales características de la EA es la aparición de placas seniles o amiloides. Las placas seniles son depósitos extra-neuronales conformados por la acumulación del péptido Aβ-42 (péptido β-amiloide), producido por la proteólisis de la proteína precursora amiloide (APP) por β-secretasa y γ-secretasa. En cambio, la escisión no patológica de APP se produce por α-secretasa y γ-secretasa. Se prevé que la EA afecte a más de 150 millones de personas para 2050, convirtiéndose en un problema socioeconómico grave. Pese a todos los esfuerzos, aún no se ha conseguido ninguna terapia efectiva. Debido a la ineficacia en las terapias contra las dianas terapéuticas conocidas actualmente, en el presente trabajo hemos investigado la proteína SFRP1 como una nueva diana terapéutica potencial. SFRP1 se encuentra sobre-expresada en pacientes con EA produciendo inhibición de ADAM10 (α-secretasa), favoreciendo la formación del péptido β-amiloide. Hemos desarrollado, de forma teórica, un proyecto para conseguir compuestos que inhiban SFRP1 e impidan su unión a ADAM10, de forma que esta α-secretasa pueda realizar su función. Para este proyecto teórico asumimos que disponemos de una librería con numerosos compuestos químicos a partir de la cual diseñamos un proceso de drug discovery con el objetivo de conseguir un compuesto con capacidad de inhibir a SFRP1 cuyas propiedades permitan su uso como fármaco. Para ello hemos desarrollado un pre-cribado computacional y un posterior ensayo de alto rendimiento (HTS) mediante FRET. Este ensayo nos permitiría identificar qué compuestos cuentan con un mayor porcentaje de inhibición y serían re-evaluados con ensayos HTS para seleccionar aquellos con menor IC-50 y mayor selectividad frente a SFRP1. A continuación, se evaluarán mediante un ensayo PAMPA los compuestos con capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica y se realizarán estudios in vivo en células telencefálicas e in vitro en modelos de murinos de EA para confirmar su eficacia. Por último, se desarrollarían estudios pre-clínicos de farmacología y toxicología de los compuestos seleccionados, como paso previo al estudio del fármaco en ensayos clínicos para comprobar si finalmente podría usarse como tratamiento de la EA.