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Dianas | Vol 6 Num 1 | marzo 2017 | e20170301b01

Estudio de la función del IRS-4 en el eje Hipotalámico Hepático.

Patricia Sanmartín Salinas^1, a, Miguel Ángel Toro Londoño¹, Antonio Jiménez Ruiz¹, María Val T. Lobo², Luis González-Guijarro¹

1. Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. 28871 Alcalá de Henares.  2. Departamento de Biomedicina y Biotecnología, Universidad de Alcalá. 28871 Alcalá de Henares.

a. patry.sanmartin@gmail.com

II Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2017.
14-16 de marzo, 2017. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión 1b, Cáncer.

Palabras clave: IRS-4; insulina; resistencia; hepatocitos; hipotálamo

Resumen

Los substratos del receptor de insulina (IRSs) son una familia de proteínas citoplasmáticas con función adaptadora. No poseen actividad enzimática intrínseca pero actúan como proteínas de anclaje iniciando y organizando la respuesta intracelular [1, 2]. Los IRSs son intermediarios en la cascada de señalización de la insulina e IGF-1 y median la respuesta sobre la expresión de genes modulando las cascadas de AKT y ERK [3]. Hasta el momento se han caracterizado tres IRSs en humanos, el IRS-1 y 2 han sido ampliamente estudiados, sin embargo estudios recientes parecen indicar que IRS-4 tiene un mecanismo de acción específico e independiente del resto de proteínas de su familia [4, 5]. Los objetivos de este trabajo son localizar el IRS-4 en distintas partes del cerebro de la rata, en un hepatocarcinoma humano y por ultimo estudiar el IRS-4 en la cascada de señalización de la insulina, IGF-1 y el punto de control G1 del ciclo celular. MATERIALES Y METODOS: Para estudiar la expresión y localización del IRS-4 en el cerebro de la rata y en un hepatocarcinoma humano se realizaron mediante técnicas de imunohistoquímica. Para estudiar el efecto de la sobreexpresión del IRS-4 y su papel en el ciclo celular, se llevó a cabo la construcción de un plásmido donde se incorporó la secuencia codificante de la proteína IRS-4. Posteriormente las células HepG2 fueron transfectadas de forma estable y se evaluaron tanto los efectos de la sobrexpresión del IRS-4 como el tratamiento con insulina e IGF-1 en células HepG2 en cultivo mediante análisis de actividad metabólica, western blot y qPCR. RESULTADOS: En los estudios in vivo por imunohistoquímica en el cerebro de la rata se observó la presencia de IRS-4 en la región hipotalámica y a lo largo del giro dentado del hipocampo con una localización citoplasmática y nuclear. En el cerebelo el IRS-4 fue apenas visible concentrándose en las células de Purkinje. En el hepatocarcinoma la expresión de IRS-4 fue mucho más notable en la zona tumoral con una localización nuclear. En los estudios in vitro tanto la insulina como el IGF-1 produjeron la fosforilación de AKT, ERK y Rb en células HepG2 control pero el efecto de los mitógenos fue mínimo en células con altos niveles de IRS-4. La sobreexpresión de dicha proteína aumentó los niveles de pAKT, pERK, Ciclina D1, CDK4, Ciclina E y CDK2 iniciando así el ciclo celular. CONCLUSION: El IRS-4 está presente en el cerebro de la rata y en hepatocitos humanos. Al incrementar los niveles de IRS-4 en células HepG2 se produce una desensibilización al IGF-1 y en especial a la insulina que podría estar mediada a través de la fosforilación de Rb.

1. M.F. White, IRS proteins and the common path to diabetes, Am J Physiol Endocrinol Metab, 283 (2002) E413-422.
2. X.J. Sun, P. Rothenberg, C.R. Kahn, J.M. Backer, E. Araki, P.A. Wilden, D.A. Cahill, B.J. Goldstein, M.F. White, Structure of the insulin receptor substrate IRS-1 defines a unique signal transduction protein, Nature, 352 (1991) 73-77.
3. M.F. White, The IRS-signalling system: a network of docking proteins that mediate insulin action, Mol Cell Biochem, 182 (1998) 3-11.
4. G.J. Ikink, M. Boer, E.R. Bakker, J. Hilkens, IRS4 induces mammary tumorigenesis and confers resistance to HER2-targeted therapy through constitutive PI3K/AKT-pathway hyperactivation, Nat Commun, 7 (2016) 13567.
5. E.P. Cuevas, O. Escribano, J. Monserrat, J. Martínez-Botas, M.G. Sánchez, A. Chiloeches, B. Hernández-Breijo, V. Sánchez-Alonso, I.D. Román, M.D. Fernández-Moreno, L.G. Guijarro, RNAi-mediated silencing of insulin receptor substrate-4 enhances actinomycin D- and tumor necrosis factor-alpha-induced cell death in hepatocarcinoma cancer cell lines, J Cell Biochem, 108 (2009) 1292-1301.

Dianas 6(1) > Orea-Martínez etal

Dianas | Vol 6 Num 1 | marzo 2017 | e20170301b02

Perfil de metilación de líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a los tratamientos hormonales.

María Jesús Orea Martínez, Ana González Corpas, Begoña Colás Escudero, Santiago Ropero Salinas

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. oreamariajesus@gmail.com, oreamariajesus@gmail.com

II Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2017.
14-16 de marzo, 2017. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión 1b, Cáncer.

Palabras clave: Cáncer de próstata; receptor de andrógenos; modificaciones epigenéticas; metilación del DNA; bloqueo hormonal

Resumen

El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte entre los hombres en los países desarrollados. La mayoría de los tumores de próstata son dependientes de andrógenos en el momento del diagnóstico, de ahí que uno de los tratamientos clásicos sea el bloqueo hormonal mediante la ablación androgénica con agonistas de la hormona luteinizante (LHRH). Aunque prolonga la supervivencia, la respuesta a estos tratamientos es limitada y de forma casi invariable los pacientes desarrollan resistencia al bloqueo hormonal continuado [1,2]. Los cambios en las modificaciones epigenéticas juegan un papel decisivo en el desarrollo y progresión del cáncer, así como en el desarrollo de la resistencia de los tumores a los tratamientos convencionales [3]. En este trabajo nos propusimos analizar el papel de la metilación del DNA en el desarrollo de resistencia de los tumores de próstata al bloqueo hormonal. Para ello hemos comparado el perfil de metilación de las células LNCaP, que expresan el receptor de andrógenos (RA) y responden a los tratamientos hormonales, y las LNCaP abl, que no responden al tratamiento hormonal, pero siguen expresando el RA [4], mediante un array que permite determinar el estado de metilación de más de 450.000 CpGs distribuidas a lo largo de todo el genoma. Dado que la metilación de la región promotora de los genes se correlaciona con una disminución en la expresión de los mismos [5], cruzamos los datos obtenidos en el array de metilación con los datos de un array previamente publicado [6] donde se comparó el perfil de expresión de este mismo sistema celular. De estos ensayos hemos seleccionado dos grupos de genes en función de las diferencias de metilación y expresión; el primer grupo incluye los genes que se encuentran hipermetilados en las células LNCaP abl con respecto a las LNCaP y por tanto presentan una disminución en su expresión, y un segundo grupo donde los genes seleccionados se encuentran hipometilados y con un aumento de expresión en la línea LNCaP abl. De estos hemos seleccionado para su posterior estudio un gen de cada grupo; CLDN3 y EGF; CLDN3 es un gen que interviene en las uniones estrechas entre células y que se encuentra hipermetilado y sin expresión en la línea LNCaP abl y EGF (factor de crecimiento epidérmico) que se encuentra hipometilado y con un aumento de expresión en la línea resistente al tratamiento con antriandrógenos. Una vez validados los datos de expresión y de metilación en ambos genes analizamos la relevancia funcional de los cambios de expresión de estos dos genes en nuestro sistema celular. Dado que CLDN3 está involucrado en la unión entre células [7] decidimos realizar ensayos de adhesión, migración e invasión, y encontramos que la adhesión y la migración disminuye en las células que no responden a los tratamientos hormonales (LNCaP abl) mientras que la invasión aumentó en estas mismas células. A la vista de los resultados obtenidos podemos concluir que hemos identificado un grupo de genes cuya expresión está regulada por cambios en el estado de metilación de su región promotora en líneas celulares de cáncer de próstata que no responden a andrógenos y, cuyos cambios de expresión podrían tener un papel relevante en el desarrollo de tumores de próstata resistentes a los tratamientos hormonales.

1. Dehm, SM; Tindall, DJ. 2007. Androgen receptor structural and functional elements: role and regulation in prostate cancer. Mol Endocrinol, 21:2855-2863.
2. So, AI; Hurtado-Coll, A; Gleave, ME. 2003. Androgens and prostate cancer. World J Urol, 21:325-337.
3. Esteller, M. 2008. Epigenetics in Cancer. The New England Journal of Medicine 358: 1148-1159.
4. Culig, Z; Hoffmnn, J; Erdel, M; Eder, IE; Hobisch, A; Hittmair, A; Bartsch, G; Utermann, G; Schneider, MR; Parczyk, K; Klocker, H. 1999. Switch from antagonist to agonist of the androgen receptor blocker bicalutamide is associated with prostate tumour progression in a new model system. British Journal of Cancer: 81 (2), 242-251.
5. Turek-Plewa, J; Jagodzinski, PP. 2005. The role of Mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cellular & Molecular biology letters 10: 631-647.
6. Wang, Quianben. 2009. Androgen Receptor Regulates a Distinct Transcription Program in Androgen Independent Prostate Cancer. Cell: 138(2):245-256.
7. Morin J, Patrice. 2005. Claudin Proteins in Human Cancer: Promising New Targets for Diagnosis and Therapy. Cancer Res: 65, 9603-9606.