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dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803a31

Detección y caracterización de interacciones físicas y moleculares en cultivos celulares 3D.

Verónica López Llorente^a, José Luis Jorcano Noval

Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT). Dirección Completa. Avenida Complutense, 40 (Madrid).España. Email: . Universidad Carlos III de Madrid, Avenida de la Universidad 30, Leganés (Madrid). España. Dpto.Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá de Henares (Madrid), España.

a. veronica.lopez.llorente@gmail.com; veronica.lopez@ciemat.es, veronica.lopez.llorente@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3 – Biología y Tecnología Celular

Palabras clave: morfogénesis epidérmica; microscopía confocal, cell tracking, cultivos 3D, AFM

Resumen

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS: Además de las señales bioquímicas, factores de crecimiento, hormonas, citoquinas y una compleja red de señalización celular que se encargan de regular procesos de proliferación, diferenciación y migración celular, así como de apoptosis, también se conoce que factores extrínsecos como fuerzas de tracción célula-célula y matriz- célula regulan el comportamiento celular. En tejidos biológicos vivos, estas fuerzas inter e intracelulares son esenciales para mantener la estructura y función del tejido y tienen una gran relevancia en el mantenimiento de la homeostasis (DuFort et al. 2011). La capacidad de las células para integrar esta información mecánica (mecanotransducción) también tiene un papel central en un amplio rango de procesos biológicos y se ha demostrado que tiene implicaciones importantes durante el desarrollo tisular y en el comienzo y progresión de muchas enfermedades (Orr et al. 2006, Ingber 2006). Sin embargo los mecanismos moleculares desencadenados por las respuestas bioquímicas de estas fuerzas mecánicas aún no se conocen bien, debido a la falta de métodos adecuados para medir estas fuerzas intercelulares con una alta resolución espacial y temporal. Por este motivo, el objetivo principal de mi trabajo es desarrollar una nueva metodología experimental para medir la evolución espacio-temporal de las fuerzas intercelulares en tejidos tridimensionales, en concreto durante la morfogénesis epidérmica, mediante experimentos de cell tracking y medición de fuerzas celulares. MÉTODOS: Estos estudios se realizan sobre cultivos organotípicos tridimensionales generados in vitro a partir de queratinocitos y fibroblastos obtenidos de biopsias humanas mediante digestión enzimática y plasma humano procedente de voluntarios sanos. Para los experimentos de cell tracking, dos poblaciones de queratinocitos se transducen para que expresen H2B-GFP y H2B-mCherry respectivamente, de manera que somos capaces de crear una piel in vitro en la que un porcentaje elevado de queratinocitos expresan GFP en su núcleo y alrededor de un 3% de queratinocitos expresan mCherry, lo que facilita la tarea de reconocimiento de los grupos celulares de la membrana basal que van a ser visualizados mediante microscopía confocal a diferentes tiempos durante el proceso formación del epitelio. Para los experimentos de medición de fuerzas, se utiliza un microrod (varilla) de fibra de carbono que es posicionado en la muestra en el momento del inicio de la diferenciación epidérmica. Así, cuando las células comienzan a formar las distintas capas de la epidermis, esta varilla se deforma. Conociendo las propiedades físicas de la fibra de carbono, somos capaces de calcular las fuerzas que están ejerciendo las células a partir de la deformación que han originado las mismas sobre la varilla mediante el análisis de las imágenes obtenidas por microscopía confocal. Además, también se ha incluido en los experimentos, la validación de los resultados obtenidos de la medición de fuerzas a través del método propuesto, mediante la utilización de microscopía de fuerza atómica. El reto que plantean estos estudios es principalmente la inestabilidad de la matriz tridimensional de fibrina que actúa como dermis sustentando el sistema sobre el que se realizan las medidas, ya que se trata de una estructura dinámica que sufre remodelaciones y cambios en su composición a lo largo de los 21 días necesarios para la diferenciación completa de la piel. Por este motivo, como parte de los objetivos del proyecto, se está trabajando en la mejora y optimización de la matriz 3D, mediante la inclusión de nuevos biomateriales naturalmente presentes en la piel.