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dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803b12

Inmunohistoquímica en ganglios de la raíz dorsal transparentes tras marcaje retrógrado de neuromas experimentales en ratón.

Laura Bernal^a, Carolina Roza

Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. laura.bernal@uah.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B1 – Fisiología

Palabras clave: ganglio de la raíz dorsal; nervio periférico; marcaje retrógrado; inmunohistoquímica; inCLARITY

Resumen

La caracterización molecular de neuronas axotomizadas se realiza generalmente con inmunohistoquímica en secciones congeladas de ganglio de la raíz dorsal y nervio perifério. Esta técnica es tediosa, larga y lleva a la pérdida de información. El uso de microscopía confocal en tejido no-seccionado no es posible debido a la dispersión de la luz, un problema que fue solucionado con el desarrollo de la técnica CLARITY [1]. Desde entonces se han desarrollado numerosos protocolos que tarnsforman tejido intacto en una estructura ópticamente transparente, que en combinación con inmunohistoquímica y marcaje retrógrado, permiten la reconstrucción 3D de tractos neuronales. Nos propusimos adaptar el primer protocolo descrito por uno simplificado, pasivo y de precio reducido (inCLARITY) para estudiar el sistema nervioso periférico. Evaluamos su compatibilidad con diferentes marcadores retrógrados (DiI, Fluoro-gold -FG-, Fluoro-ruby -FR-, Fluoro-emerald -FE- and Retrobeads -RB-) así como con inmunohistoquímica específica contra nociceptores. En ratones adultos se realizó una cirugía en la cual se seccionan dos de las tres ramas periféricas del nervio ciático, que fueron luego introducidas en un tubo para evitar la reinervación. En el extremo cortado se marcó con los diferentes marcadores retrógrados. La incisión se cerró. Dos semanas después los animales fueron perfundidos y el tejido extraido y procesado para cryo-sección (crioprotegido en sacarosa 30% y congelado en OCT) o para transparentación (embebido en una mezcla de acrilamida/bisacrilamida/V-50 durante 4h a 37ºC y después en SDS 8%). En el tejido transparente se realizó inmunohistoquímica en free-floating frente a marcadores de nociceptores (IB4 y CGRP) y fibras periféricas (IB4, PanNav). Nuestros resultados muestran como el protocolo implementado (inCLARITY) funciona perfectamente en ganglios de la raíz dorsal y nervios periféricos en 7-12 días, sin producir cambios en volumen o estructura. Además, todos los marcadores retrógrados fueron compatibles con esta técnica. Al igual que en las crio-secciones, FG marcó muchas células, la mayoría de ellas con citoplasma vacuolado. La tinción de DiI fue pobre para ambos protocolos. FR y FE en crio-secciones solo se visualizaron después de inmunotinción contra el fluoróforo, pero ambas se observaron directamente con inCLARITY. RB se observaron bien y con un fondo muy bajo mediante el uso de ambas técnicas. Además, IB4 y CGRP se observaron claramente en ganglios transparentes. En nervios transparentes, la tinción con IB4 mostró claramente diferencias entre fibras intactas y dañadas y los nodos de Ranvier se identificaron fácilmente con el marcador PanNav. Como conclusión, podemos afirmar que hemos desarrollado con éxito un nuevo protocolo asequible para todos los laboratorios y que hace transparente tejido nervioso periférico. Además, este método presenta varias ventajas en comparación con el procesamiento tradicional. Hemos demostramos su compatibilidad con cinco trazadores retrógrados diferentes utilizados comúnmente en el área de la neurobiología. Además, mostramos cómo es posible realizar inmunotinción para fenotipar diferentes poblaciones neuronales. Con respecto a los nervios periféricos, la inmunohistoquímica en nervios transparentes permite estudiar los cambios morfológicos y moleculares después de la axotomía sin alterar su estructura.

1. Chung K, Wallace J, Kim SY, Kalyanasundaram S, Andalman AS, Davidson TJ, Mirzabekov JJ, Zalocusky KA, Mattis J, Denisin AK, Pak S, Bernstein H, Ramakrishnan C, Grosenick L, Gradinaru V, Deisseroth K. 2013. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. May 16;497(7449):332-7. doi: 10.1038/nature12107.