dianas 9(1) > Asenjo-Bueno etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003b12

Los antioxidantes mejoran la disfunción endotelial presente en la aterosclerosis causada por el exceso de fibrosis.

Ana Asenjo-Bueno, Elena Alcalde-Estévez, Mariam El Assar-de la Fuente, Sara Nieto-Mateos, Patricia Sosa, Patricia Plaza, Gemma Olmos, Susana López-Ongil

Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Príncipe de Asturias.

a. luaasbu19@gmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: aterosclerosis; fibrosis; disfunción endotelial; ROS

Resumen

Actualmente, las enfermedades cardiovasculares se han posicionado como una de las principales causas de mortalidad, entre cuyos factores de riesgo cabe destacar la aterosclerosis. Es característico en esta patología el desarrollo de disfunción endotelial, así como la dislipidemia y el estrés oxidativo. En base a ello, el objetivo de este estudio fue analizar los posibles mecanismos de disfunción vascular en la aterosclerosis. Para describir las lesiones vasculares se utilizaron ratones macho deficientes en Apoproteína E (KO-ApoE), modelo animal típico de aterosclerosis humana, y ratones WT. Para profundizar en el análisis de los posibles mecanismos se utilizaron cultivos de células musculares lisas y endoteliales humanas. Los ratones KO-ApoE presentaban mayores niveles séricos de colesterol y de ET-1, implicada en la disfunción endotelial, así como una PAS más alta que sus homólogos WT. Además, estudios de reactividad vascular realizados en arterias mesentéricas evidenciaron mayor disfunción vascular en el grupo de animales KO-ApoE, pues presentaban mayor contracción y se relajaban peor que los WT. El análisis de las aortas por inmunohistoquímica mostró mayor intensidad en la tinción de Rojo Sirio, que tiñe fibras de colágeno, y menor expresión de elastina en los ratones KO-ApoE, lo que es compatible con el desarrollo de disfunción vascular observado, dado que presentarían mayor grado de fibrosis y menor elasticidad. Para estudiar un posible mecanismo, se incubaron células endoteliales y musculares lisas con LDL oxidadas (oxLDL), confirmando que en el endotelio aumentaba la expresión de ECE-1 y la producción de ET-1. Además, el tratamiento con oxLDL indujo en ambos tipos celulares la producción de radicales libres (ROS) medidos por microscopia Confocal utilizando la sonda CellROX. También aumentó la expresión de proteínas pro-fibróticas como el TGF-β, y de matriz extracelular como la fibronectina y el colágeno-I, analizadas por Western blot e inmunofluorescencia. Los ROS parecen ser los responsables de estos cambios dado que en presencia del antioxidante N-Acetilcisteína (NAC), las oxLDL no inducían fibrosis en estas células. Con el fin de confirmar si los ROS podían ser responsables de los efectos observados en los ratones KO-ApoE se administró a un grupo un tratamiento con el antioxidante Taurina al 2% disuelta en el agua de bebida durante los últimos 3 meses. El tratamiento con Taurina redujo la producción de ET-1, el desarrollo de disfunción endotelial y la fibrosis, mejorando incluso la expresión de elastina. En resumen, se puede sugerir que los antioxidantes podrían ser una terapia útil para prevenir la disfunción endotelial causada por el exceso de fibrosis provocado por la aterosclerosis.

dianas 9(1) > Alcalde-Estévez etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003b11

Métodos de diagnóstico de sarcopenia en animales de experimentación.

Elena Alcalde-Estévez, Patricia Sosa, Ana Asenjo-Bueno, Patricia Plaza, Sara Nieto-Mateos, Gemma Olmos, Susana López-Ongil, María Piedad Ruiz-Torres

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. 28871, Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. elena_22_93@hotmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Keywords: Sarcopenia; envejecimiento; músculo esquelético; animales de experimentación

Abstract

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO: La sarcopenia se define como una pérdida de fuerza y masa muscular que acontece con la edad. Se trata de una de las patologías que condiciona de forma más importante la calidad de vida y dependencia de las personas, por lo que su estudio es fundamental para lograr un envejecimiento más saludable. En 2010 el Grupo Europeo de trabajo en Sarcopenia en Ancianos (EWGSOP) introdujo por primera vez un algoritmo diagnóstico para la sarcopenia mediante la valoración de las tres variables más importantes de la sarcopenia: masa muscular, fuerza muscular y actividad física. El objetivo de este trabajo es analizar diferentes parámetros del músculo esquelético y actividad física de ratones con el fin de establecer un método de diagnóstico de sarcopenia en animales de experimentación. MÉTODOS: Se emplearon al menos 20 ratones de la cepa C57BL6 macho jóvenes (de 5 meses) y 20 viejos (de 24 meses). La masa muscular se estimó midiendo el peso relativo de los músculos gastrocnemio y tibial. El estudio de la calidad del músculo se realizó mediante resonancia magnética y la composición de fibras musculares mediante las tinciones histológicas succinato deshidrogenasa y rojo sirio. La fuerza muscular se analizó mediante el test de agarre y la técnica de electroestimulación para medir la contracción del músculo tibial. Finalmente, se evaluaron las capacidades motoras estudiando la velocidad de la marcha, el análisis de la pisada y la coordinación motora en barra estática. Además, se realizó un análisis estadístico de correlación entre las diferentes variables para estimar cuáles diagnostican de forma más precisa la sarcopenia. RESULTADOS: Con el envejecimiento se produce una disminución en el peso relativo de los músculos gastrocnemio y tibial de los ratones. La resonancia magnética reveló una alteración en los parámetros de calidad del músculo: difusividad media, transferencia de magnetización y tiempo de relajación. El análisis histológico del músculo gastrocnemio indicó una menor área de sección transversal de las fibras en los ratones viejos, un mayor número de fibras oxidativas o tipo I y una mayor presencia de fibrosis. Los ratones envejecidos mostraron una disminución significativa en su fuerza de agarre y la capacidad contráctil del músculo tibial. Además, el análisis de la marcha reveló una disminución en la velocidad de los ratones viejos, así como una menor zancada y una mayor anchura de pisada. Por último, con la prueba de la barra estática se determinó una pérdida de la orientación y la coordinación motora de los ratones envejecidos. Los parámetros que correlacionaron con mayor significancia estadística con los signos de sarcopenia fueron la fuerza de agarre, la fuerza máxima del músculo tibial, la masa muscular, la velocidad de la marcha, la longitud de la zancada, la presencia de fibrosis y el tiempo en la barra estática. CONCLUSIONES: Los parámetros analizados en el músculo esquelético de los ratones permitieron demostrar la existencia de sarcopenia en los animales viejos de forma similar a la diagnosticada en humanos. El análisis de las correlaciones reveló que los parámetros de fuerza de agarre, como medida de fuerza, la masa relativa de los músculos gastrocnemio y tibial, como medida de masa muscular, y la velocidad de la marcha o la barra estática, como medidas de actividad física, serían las variables más adecuadas para el diagnóstico de sarcopenia en animales.

dianas 9(1) > Escobar etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003b10

Indoxil sulfato induce senescencia y liberación de microvesículas en células endoteliales que promueven la calcificación vascular.

Beatriz Escobar, Guillermo Bodega, Julia Carracedo, Rafael Ramírez, Matilde Alique

1. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid, Spain.  2. Departamento de Biomedicina y Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid, Spain.  3. Departamento de Fisiología Animal (II), Facultad de Biología, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Spain.  4. Institute of Investigation, Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain.

a. beatriz.ed98@gmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: senescencia; microvesículas; calcificación vascular; células endoteliales; toxinas urémicas

Resumen

Antecedentes: Tanto los ancianos como los pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) tienen una mayor probabilidad de sufrir enfermedades inflamatorias cardiovasculares (EICVs), las cuales pueden asociarse a la calcificación vascular como inicio de las mismas. Las células endoteliales tienen una senescencia prematura como mecanismo fisiopatológico en la ECV asociada a ERC. Hemos demostrado que las microvesículas (MVs) producidas por estas células senescentes, debido a su capacidad de comunicación intercelular, pueden iniciar dicha calcificación. Además, las toxinas urémicas, como el indoxil sulfato (IS), que se relacionan con la ERC, también pueden generar una senescencia endotelial precoz, lo que puede secretar MVs que inicien la calcificación vascular. Todo esto permite que las MVs puedan ser útiles para su caracterización como biomarcadores tempranos y/o diana terapéutica en estas patologías.

Materiales y métodos: Se trataron células endoteliales (HUVEC) con IS. La senescencia se cuantificó por el método de β-galactosidasa. Por citometría de flujo se aislaron y se caracterizaron las MVs producidas por las HUVEC senescentes, y se utilizaron para el tratamiento de células musculares lisas (HASMC) durante 9, 20 y 30 días. En HASMC se valoraron los depósitos de calcio por el colorante rojo alizarina. A los 30 días, mediante el kit de fenolsufoneftaleina, se cuantificó el contenido de calcio. Mediante PCR cuantitativa se determinó en HASMC la expresión de genes pro-calcificantes y por western blot la expresión de un marcador específico de HASMC (SM22α).

Resultados: El tratamiento con IS indujo senescencia precoz en HUVEC (control: 7,07±2,87% vs. IS: 72,90±13,09%, p<0.0001) y se observó un incremento en la producción de MVs (control: 1,68±1.00 vs. IS: 9.92±4,29 MVs/célula, p<0.005). Las MVs procedentes de células con senescencia precoz por el efecto del IS indujeron calcificación en HASMC, en un proceso asociado a desregulación en la expresión de genes procalcificantes (Runx2, BMP2). Además, las MVs generadas en HUVEC tratadas con IS producen un proceso de desdiferenciación de las HASMC (expresión de SM22α).

Conclusión: Las células endoteliales que tienen una senescencia precoz como consecuencia del estrés oxidativo generado por las toxinas urémicas son capaces de producir MVs que promuevan la calcificación vascular. Su cuantificación en plasma permite que se pueda utilizar como biomarcador para valorar la progresión de la enfermedad en sujetos susceptibles y para diseñar dianas terapéuticas que eviten la generación o la presencia en el espacio extracelular de MVs procalcificantes.

dianas 9(1) > Figuer etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003b09

Senescencia celular acelerada en pacientes con enfermedad renal crónica.

Andrea Figuer, Nadia Serroukh, Gema Valera, Noemí Ceprián, Enrique Morales, Matilde Alique, Julia Carracedo

1. Universidad Complutense de Madrid, Departamento de Medicina.  2. Universidad Complutense de Madrid, Departamento de Fisiología.  3. Universidad de Alcalá, Departamento de Biología de Sistemas.

a. andrea.figuer25@gmail.com; afiguer@ucm.es

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Senescencia; Enfermedad Renal Crónica; Diálisis; Trasplante renal; Perfil Secretor Senescente

Resumen

Los pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) se caracterizan por un deterioro renal, que tiene como consecuencia la acumulación de toxinas urémicas. Estos pacientes presentan un envejecimiento acelerado (EA), posiblemente asociado con una edad biológica superior a la edad cronológica. El EA de los pacientes con ERC está relacionado con alteraciones fenotípicas y funcionales del sistema inmunitario. La desregulación inmunitaria tiene como consecuencia un empeoramiento de la calidad de vida de los pacientes con ERC, con un mayor deterioro vascular que provoca un aumento de la incidencia de accidentes cardiovasculares. El EA se atribuye a la acumulación de toxinas urémicas, que son responsables de un aumento de citoquinas proinflamatorias aumentando el estrés oxidativo y ocasionando una inflamación crónica subclínica1. El EA está asociado a un fenotipo celular secretor senescente (SASP), que consiste en la secreción de distintos productos por parte las células senescentes, entre los que se incluyen que conduce a que citoquinas proinflamatorias (IL-6, TNF-α…), quimioquinas, factores de crecimiento y factores angiogénicos2. La presencia de SAPS está relacionada con alteraciones en el microambiente tisular, aumento de la infiltración leucocitaria y malignificación celular3. Asociado a este SASP, las células inmunitarias sufren cambios, por ejemplo, se asocia con una pérdida de la función tímica y la expansión de la población de células T de memoria, y un incremento proporcional de los linfocitos T CD8 con actividad citotóxica4.
En un estudio observacional transversal llevado a cabo en pacientes con ERC avanzada en diferentes modalidades de tratamiento renal sustitutivo (conservador, hemodiálisis, diálisis peritoneal y trasplante), hemos observado una disminución significativa de los linfocitos T CD4 con respecto a los individuos sanos, siendo especialmente relevante este descenso en pacientes en hemodiálisis. Esto supuso una inversión en el cociente de CD4+/CD8+, característica que también se observa en personas con edad avanzada. Además, iba asociado a un descenso en el porcentaje de linfocitos B5. Sin embargo, no se observaron cambios en las concentraciones de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA), ni en factores del complemento (C3, C4). En conclusión, nuestros resultados muestran un estado de inmunodeficiencia en pacientes con ERC en todas las modalidades de tratamiento renal sustitutivo, que podría estar íntimamente relacionado con el EA asociado a estos pacientes. Estos parámetros pueden ser usados como biomarcadores de complicaciones patológicas en los pacientes con ERC y podrían modularse de forma que se pueden establecer como dianas terapéuticas de seguimiento diagnóstico para establecer tratamientos que puedan revertir y/o prevenir el EA en ERC.

1. Kooman, J. P., Kotanko, P., Schols, A. M. W. J., Shiels, P. G., & Stenvinkel, P. (2014). Chronic kidney disease and premature ageing. Nature Reviews Nephrology, 10(12), 732–742. doi:10.1038/nrneph.2014.185


2. Wang, W., Cai, G. & Chen, X. (2017), Cellular senescence, senescence-associated secretory phenotype, and chronic kidney disease", Oncotarget, vol. 8, no. 38, pp. 64520-64533.


3. Dai, L., Qureshi, A.R., Witasp, A., Lindholm, B. & Stenvinkel, P. (2019), Early Vascular Ageing and Cellular Senescence in Chronic Kidney Disease, Computational and Structural Biotechnology Journal, vol. 17, pp. 721-729


4. Betjes, M. G., & Litjens, N. H. (2014). Chronic Kidney Disease and Premature Ageing of the Adaptive Immune Response. Current Urology Reports, 16(1). doi:10.1007/s11934-014-0471-9


5. Pahl MV, Gollapudi S, Sepassi L, Gollapudi P, Elahimehr R, Vaziri ND. (2010) Effect of end-stage renal disease on B-lymphocyte subpopulations, IL-7, BAFF and BAFF receptor expression. Nephrol Dial Transplant. 25(1):205–212. doi:10.1093/ndt/gfp397