dianas 8(1) > González-cofrade etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903p07

Novel anti-inflammatory agents via inhibition of NF-kappaB and/or Inflammasome pathways: a series of hispanolone-derived diterpenes.

L González-cofrade, I Cuadrado, A Estévez-Braun, S Hortelano, B. Las Heras

Departamento de Farmacología, Farmacognosia y Botánica. Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid.

a. lagonz11@ucm.es; lauragoncof@gmail.com

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España
Sesión de paneles.

Keywords: Inflammation; diterpenes; NF-κB; MAPKs; inflammasome

Abstract

Inflammation is a crucial host response triggered by invading pathogens and injured tissue. Natural products have played a significant role in human health as a source of new drugs to prevent and treat inflammatory conditions. Diterpenes are bioactive natural products with great therapeutic potential and are considered very promising starting points for the development of new therapeutic agents. In this study, a series of seventeen novel hispanolone derivatives (N1-N17) were synthesized and evaluated for potential anti-inflammatory activity in J774A.1 macrophages. We focused on their potential as inhibitors of classical inflammatory pathways (NF-κB/MAPKs) and/or NLRP3 inflammasome activation. All compounds except N2 and N5 were non-cytotoxic, as revealed the MTT assay. To evaluate the effects of diterpenes on NF-κB pathway, macrophages were activated with lipopolysaccharide (LPS) in the absence or presence of these compounds. Inhibitory effects of the non-toxic derivatives on nitric oxide (NO) production were evaluated. Hispanolone derivatives N1 and N12 were the most active compounds (IC50 in the range 10-20 µM) so they were selected for further evaluation. NOS-2 and COX-2 expression were significantly inhibited, as observed by western blot. Moreover, the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) ERK1/2, p38 and JNK was also reduced by pre-incubation with N1 and N12. We also investigated their potential as regulators of NLRP3 inflammasome. Cell treatment with diterpenes N12, N13, N16 and N17 at 20 µM significantly reduced IL-1β secretion in LPS/ATP or LPS/Nigericin-stimulated macrophages. Western blot analyses also confirmed that these compounds inhibited IL-1β and cleaved caspase-1 protein expression. In conclusion, these results show the promising anti-inflammatory effects of some hispanolone derivatives, in particular N12, acting on a dual level. This diterpene not only inhibits NF-κB/MAPKs signalling pathways, but also regulates inflammasome activation.

dianas 8(1) > Serna-Blasco etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903p06

Warburg metabolic shift induced by vitamin C in KRAS mutant CRC.

Roberto Serna-Blasco, Óscar Aguilera-Martinez, Jesús García-Foncillas

Fundación Jiménez Díaz.

a. roberto.sb.93@gmail.com; roberto.serna@quironsalud.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España
Sesión de paneles.

dianas 8(1) > Sánchez-Baltasar etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903p05

Breast cancer animal models: Rasa1 knockout.

Raquel Sánchez-Baltasar, Angustias Page, Isabel Ojeda-Pérez, Claudia Gil-Pitarch, Manuel Navarro, Ángel Ramírez

CIEMAT-Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre.

a. raquel.sanchez@externos.ciemat.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España
Sesión de paneles.

Keywords: Cáncer de mama; Rasa1; Tpr53; CRISPR/Cas9

Abstract

El cáncer de mama es el tipo de tumor que ocupa el primer puesto en incidencia en la población femenina mundial y es uno de los que mayor mortalidad causa. A pesar de que es frecuente encontrar mutaciones en los genes clásicos de la familia de Ras en otros tipos tumorales, no lo es en cáncer de mama, aunque la vía se encuentra frecuentemente sobreactivada en algunos subtipos como los triple negativos o basales. Estudios previos en nuestro laboratorio sugieren que esto puede deberse a la pérdida alélica de RASA1 en concomitancia con mutaciones en el gen TP53, eventos frecuentes en estos subtipos tumorales que son los más agresivos y de peor pronóstico. Por ello, hemos decidido llevar a cabo un estudio en profundidad de los mecanismos moleculares que llevan al desarrollo y/o progresión del cáncer de mama como consecuencia de la alteración de estos dos genes. En consecuencia, se planteó la generación de modelos animales deficientes en Rasa1 en combinación con mutaciones en Trp53 con el objetivo de confirmar la colaboración de la activación de la vía de Ras y p53 como causante de cáncer de mama. Para el desarrollo de estos modelos animales modificados genéticamente se empleó la tecnología CRISPR/Cas9. Para ello, se diseñó una pareja de guías específicas para el gen Rasa1 con el objetivo de utilizarlas mediante dos aproximaciones diferentes. En primer lugar, con el objetivo futuro de realizar el aloinjerto de células de glándula mamaria electroporadas con las guías diseñadas para Rasa1 (e infectadas con un vector lentiviral para la sobreexpresión de una forma mutada de p53), se realizó una puesta a punto extrayendo y purificando estas células de hembras donadoras e infectándolas con un vector lentiviral que expresa la proteína GFP para trasplantarlas en la almohadilla grasa desepitelizada de hembras receptoras. Por otro lado, se empleó la tecnología CRISPR/Cas9 para realizar la edición del gen Rasa1 en estadio embrionario. Las guías específicas para este gen se introdujeron en los zigotos junto con la Cas9 en forma de ribononucleoproteína mediante electroporación por dos métodos: iGonad (“Oviductal Nucleic Acids Delivery”) o ZEN (“Zygote Electroporation of Nucleases”). En el modelo de aloinjerto se observó una reconstitución del epitelio de la glándula mamaria con las células trasplantadas a 2 meses post-trasplante, verificando la utilidad de esta aproximación para la generación de nuestro modelo. Respecto a la electroporación de los zigotos, aunque con el método iGonad no se vio edición en ninguno de los casos, con el método ZEN se consiguió un 75% de edición, donde en más del 80% de estos animales se observó un cambio de expresión de la proteína RASA1. En conclusión, tanto la aproximación del aloinjerto en la glándula mamaria como la utilización del método ZEN para la generación de modelos animales modificados genéticamente con la tecnología CRISPR/Cas9 para el gen Rasa1, pueden ser una buena aproximación para el estudio de la implicación de este gen en el cáncer de mama.

dianas 8(1) > García-García etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903p04

Signos de envejecimiento acelerado en los ratones transgénicos que sobreexpresan IKKα en el núcleo.

Verónica García-García, Josefa P. Alameda, Federico Sánchez-Sierra, Pilar Hernández, Rosa A. García, Angustias Page, M. L. Casanova

CIEMAT-CIBERONC.

a. veroga03@ucm.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España
Sesión de paneles.

Keywords: Ikkalpha, ratones transgénicos, envejecimiento prematuro, piel, cáncer

Abstract

En nuestro grupo hemos generado ratones transgénicos que, bajo el control de los elementos reguladores de la queratina K5, expresan la proteína IKKα humana en el núcleo de las células de la capa basal de los epitelios estratificados de la piel y de otros órganos internos (ratones que denominamos K5-N-IKKα). El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar el fenotipo que presentan estos ratones en estos tejidos como consecuencia de la expresión del transgén. Se han realizado estudios histológicos e inmunohistoquimicos de diferentes tejidos que han mostrado que la sobreactivación de IKKα en el núcleo provoca un fenotipo de envejecimiento prematuro en piel, caracterizado por la presencia de atrofia epidérmica junto a áreas de hiperplasia papilomatosa (dando el aspecto de arrugas), reducción del panículo adiposo y atipia de las células basales (considerada como signo de premalignidad); en la dermis se observa además inflamación con abundantes mastocitos, así como focos de inflamación liquenoide. Adicionalmente, hemos detectado el desarrollo de tumores espontáneos de diverso origen, principalmente carcinomas escamosos de piel, adenocarcinomas de pulmón y linfomas no Hodgkin de células B. Hemos obtenido los mismos resultados cuando se expresa N-IKKα en ratones deficientes en IKKα. En conjunto, las alteraciones que desarrollan los ratones que sobreexpresan IKKα en el núcleo son semejantes a las que se observan en la vejez en humanos.

dianas 8(1) > Lodewijk etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903p03

Prognostic and predictive immune gene signatures and correlation with homologous recombination deficiency in high grade serous ovarian cancer.

Iris Lodewijk, Marta Dueñas, Cristian Suárez-Cabrera, Rosa García-Martín, Luis Manso, Jesús M. Paramio

CIEMAT-IMAS12.

a. irisadriana.lodewijk@externos.ciemat.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España
Sesión de paneles.

Keywords: High grade serous ovarian cancer; Homologous recombination deficiency; Immune gene signatures; Immunotherapy

Abstract

The majority of patients with epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal cancer presents with advanced malignancy (stage III or IV disease). Standard treatment consists of primary debulking surgery (PDS) followed by chemotherapy, whereas neoadjuvant chemotherapy (NACT) can be given to patients who have unresectable disease or represent poor surgical candidates. Multiple studies have indicated that survival after NACT approximates that of suboptimal PDS. Approximately 50% of high grade serous ovarian cancers (HGSOCs) display genetic and epigenetic alterations in genes of the homologous recombination (HR) DNA repair pathway, mostly in BRCA1 and BRCA2 genes. A recent study demonstrated that tumors with higher neoantigen load show increased expression of immune genes related to tumor cytotoxicity. Moreover, immune checkpoint inhibitors (such as PD-1 and PD-L1) have shown remarkable efficacy against various hypermutated cancers. This might be due to the increased amount of tumor-specific neoantigens in hypermutated lesions which stimulates the recruitment of an elevated number of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and is counterbalanced by the increased expression of immune checkpoints. Additionally, BRCA1/2-mutated tumors have been found to show a significantly increased amount of CD3+ and CD8+ TILs, and enhanced expression of PD-1 and PD-L1 in HR deficient tumor-associated immune cells compared to HR proficient tumors. Taken together, there might be a link between BRCA1/2-mutation status and immunogenicity, and BRCA1/2-mutated HGSOCs might be more sensitive to immune checkpoint inhibitors compared to HR-proficient HGSOCs. Accordingly, this project is focused on the study of prognostic and predictive immune gene signatures and correlation with homologous recombination deficiency in HGSOC, using a combination of Immunohistochemistry, Nanostring Immuno-Oncology Assay and targeted Sequencing using Foundation one technologies. For this study, we intend to use a patient population consisting of 90 matched samples HGSOC (n=45 pts), treated with neoadjuvant induction chemotherapy (carboplatin and paclitaxel standard dose). The matched samples will be baseline biopsy and samples from Interval Debulking Surgery (IDS). We hypothesize that homologous recombination deficiency in high grade serous ovarian cancer results in a higher tumor-specific neoantigen load, and, therefore, increased tumor-infiltrating lymphocytes as well as increased expression of the immune checkpoint genes.

dianas 8(1) > García-Pastor etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903p02

Papel de la PGE₂ en la muerte inducida por hipoxia de células proximales tubulares.

Coral García-Pastor, Selma Benito-Martínez, Ana Fernández-Martínez, Javier Lucio-Cazaña

Universidad de Alcalá.

a. coralgarciapastor@gmail.com  b. selma.benito@uah.es  c. javier.lucio@uah.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España
Sesión de paneles.

Resumen

La hipoxia tisular es uno de los factores implicados en el desarrollo tanto de lesión renal aguda como crónica. Las células proximales tubulares (CPT) son particularmente susceptibles a la disponibilidad de oxígeno y se ha demostrado que la hipoxia puede llegar a inducir su muerte. Durante la hipoxia se produce un acumulo del factor inducible por hipoxia-1 (HIF-1α), que activa la transcripción de sus genes diana, entre los que se encuentra la ciclooxigenasa 2 (COX-2). COX-2 participa en la síntesis de diferentes tipos de prostaglandinas (PG), como PGE₂, que posteriormente se une a los receptores EP y activa diferentes vías de señalización. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que PGE₂ intracelular (iPGE₂) media la apoptosis inducida por cisplatino en CPT, que puede ser prevenida al inhibir el transportador de PGE₂ al interior celular con bromosulfoftaleina y, otros autores, también han demostrado su implicación en diferentes modelos de muerte celular. En este trabajo analizamos el papel que desempeñaba la vía COX-2/iPGE₂/receptores EP en la muerte por hipoxia. Para ello, inhibimos la vía mediante inhibidores de COX-2 y del trasportador de prostaglandina PGT (transportador responsable del aumento de los niveles intracelulares de iPGE₂ gracias a la captura por la célula de PGE₂ desde el medio extracelular), así como antagonistas de los receptores EP. Observamos que, en todos los casos, se produjo una reducción significativa de la apoptosis celular. Estos resultados indicaron que la vía COX-2/iPGE₂/receptores EP estaba implicada en la muerte inducida por hipoxia en células CPT. Estos resultados sugieren que los receptores EP intracelulares median la muerte por apoptosis inducida por hipoxia de las células proximales tubulares.
En conclusión, nuestro trabajo sugiere que el transportador de captación de PGE₂ puede ser una buena diana terapéutica para la prevención de la muerte de CPT inducida por hipoxia.