dianas 13(1) > Jiménez-Guirado etal

dianas | Vol 13 Num 1 | marzo 2024 | e202403x013

Nanotecnología aplicada a la resolución de la respuesta inflamatoria mediante la reducción de la infiltración monocitaria en un modelo porcino de isquemia/reperfusión miocárdica.

Beatriz Jiménez-Guirado^a, Laura Tesoro, Rafael Ramírez-Carracedo, Laura Botana, Ignacio Hernández, Javier Díez-Mata, Nunzio Alcharani, Claudia González-Cucharero, Marta Saura, Jose Luis Zamorano, Carlos Zaragoza

Hospital Universitario Ramón y Cajal.

a. b.jimenezguirado@gmail.com

IX Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2024.
XVIII Simposio de Dianas Terapéuticas.
18 a 22 de marzo, 2024. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Infarto Agudo de Miocardio (IAM); Insuficiencia Cardiaca (IC); receptor de quimiocina tipo 2 (CCR2); monocitos; macrófagos residentes de tejido (TRM); polarización de monocitos; interleucina 10 (IL-10); receptor IL-10 (IL10-R); STAT3; NIL10; Isquemia/Reperfusión (I/R)

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de defunción mundial siendo la más común el infarto agudo de miocardio (IAM). En muchos casos, el empeoramiento de esta patología conduce a la desregulación de la respuesta inflamatoria inicial, lo que resulta en un remodelado cardiaco adverso. En este contexto, el sistema fagocítico nuclear, compuesto por monocitos y macrófagos, desempeña un papel crucial. Recientemente, nuestro equipo de investigación ha desarrollado una nanopartícula (NIL10) conjugada a un análogo de la interleucina 10 (IL-10), capaz de inducir la polarización de macrófagos presentes en el tejido necrótico hacia un estado resolutivo (M2) al unirse de forma específica con el receptor de IL-10 (IL-10R). Su capacidad anti-inflamatoria ha demostrado tener un potente carácter cardioprotector en modelos animales de isquemia-reperfusión (I/R) miocárdica, facilitando una reparación tisular adecuada tras el IAM.
El proceso inflamatorio se ve aumentado debido a la expresión del receptor de quimioquina C-C tipo 2 (CCR2), un marcador celular que permite la infiltración de los monocitos clásicos (CCR2+, CD14+), mientras que los no-clásicos carecen de esta capacidad, presentando un fenotipo anti-inflamatorio (CCR2-, CD16+). Además, este marcador, facilita el seguimiento originario de los macrófagos presentes en el tejido necrótico.
Basándonos en el efecto anti-inflamatorio de NIL10 en los macrófagos, nuestra hipótesis se centra en que NIL10 podría controlar la respuesta inflamatoria inicial a través de la polarización de monocitos clásicos, mediado por IL-10R, favoreciendo un remodelado cardiaco correcto después de la generación del IAM. Por tanto, nuestro objetivo es estudiar el efecto cardioprotector de la modulación del sistema inmune promoviendo la polarización de monocitos a través del uso de nanopartículas dirigidas al IL-10R.
En el presente estudio utilizamos un modelo porcino de isquemia-reperfusión (I/R) miocárdica utilizando un total de 12 animales, divididos en distintos grupos: grupo 1 (animales control), grupo 2 (animales tratados con 1 mg/kg NIL10), grupo 3 (animales tratados con 4x105 de monocitos aislados del grupo 2), grupo 4 (animales tratados con 4x105 de monocitos aislados del grupo 1 incubados in vitro con NIL10) y grupo 5 (animales tratados con 4x105 de monocitos aislados del grupo 1). Los animales fueron tratados de forma intravenosa tras 45 minutos de isquemia, siendo sacrificados 7 días post-IAM. Analizamos la funcionalidad cardiaca mediante ecocardiografía y las poblaciones celulares mediante citometría de flujo. Evaluamos la estructura del tejido mediante estudios histológicos y la expresión de marcadores específicos mediante inmunoblot.
Nuestros resultados demostraron que los animales tratados con NIL10 directa o indirectamente (grupos 2, 3, 4) presentaban una mejora significativa de la funcionalidad cardiaca asociada a nivel histológico con un descenso de inflamación y fibrosis en la región afectada tras 7 días post-IAM, en conjunto, induciendo cardioprotección. Estos mismos grupos (2, 3, 4) presentaron, además, una reducción significativa de la población monocitaria clásica, asociada conjuntamente a una menor presencia de macrófagos CCR2+ en tejido necrótico y con una mayor activación de la ruta IL-10R/STAT3 comparado con los grupos controles (1,5), sin alteraciones en la población linfocitaria T. En definitiva, los tratamientos basados en NIL10 o en monocitos modulados por NIL10, fueron capaces de regular la respuesta inmune innata post-IAM, generando la polarización de monocitos clásicos y su infiltración, sin afectar a la inmunidad adaptativa.
NIL10 es un compuesto protegido por patente internacional que ha demostrado su eficacia en modelos preclínicos, en vías de saltar a ensayos clínicos en un futuro próximo, gracias estudios como el presente proyecto, permitiendo dilucidar su mecanismo de acción en profundidad.

dianas 13(1) > González-Cucharero etal

dianas | Vol 13 Num 1 | marzo 2024 | e202403x011

Nuevo modelo preclínico de insuficiencia tricúspide para la búsqueda de marcadores moleculares y dianas terapéuticas de dilatación auricular y arritmias.

Claudia González-Cucharero, Rafael Ramírez-Carracedo, Laura Tesoro, Laura Botana, Ignacio Hernández, Javier Díez-Mata, Nunzio Alcharani, Beatriz Jiménez-Guirado, José Luis Zamorano, Carlos Zaragoza

Hospital Universitario Ramón y Cajal.

a. claudia311099@gmail.com

IX Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2024.
XVIII Simposio de Dianas Terapéuticas.
18 a 22 de marzo, 2024. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Insuficiencia tricuspídea; modelo porcino; conexinas; TGF-β

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares suponen la primera causa de muerte en el mundo y, de ellas, las valvulopatías destacan por su elevada incidencia y su implicación en el desarrollo de enfermedades más severas, como la insuficiencia cardiaca o arritmias. La insuficiencia tricuspídea (IT) conlleva el cierre incompleto de la válvula tricúspide, que se encuentra entre la aurícula y ventrículo derechos del corazón. Entre sus consecuencias más frecuentes se encuentran la dilatación auricular y ventricular y el retorno sanguíneo hacia la cavidad cardiaca superior, proceso conocido como regurgitación tricuspídea. Esta alteración supone un daño mecánico en el tejido que, a largo plazo puede causar un remodelado adverso de la matriz extracelular y la aparición de focos ectópicos de corriente eléctrica. En definitiva, puede causar la cronicidad y el desarrollo de patologías mucho más graves, como las arritmias.

El objetivo de nuestro trabajo es diseñar un modelo porcino de IT replicable, poco lesivo, económico y que desarrolle la patología de forma inmediata a fin de acortar los plazos del experimento y mejorar el bienestar animal. Este modelo con alto valor traslacional por sus similitudes fisiológicas, hemodinámicas y electrofisiológicas nos permitirá llevar a cabo estudios preclínicos a nivel experimental en la patología valvular.

La IT se ha generado mediante la implantación percutánea de un filtro de vena cava inferior (IVC) entre la aurícula (AD) y ventrículo derecho (VD) para fijar los velos de la válvula tricúspide y mantenerla permanentemente abierta. Semanalmente se evaluaron parámetros hemodinámicos y ecocardiográficos, como cambios en el flujo sanguíneo, la frecuencia cardiaca (FC) y el área de las cámaras cardiacas, así como alteraciones en el ritmo cardiaco durante 30 (N=2) o 60 días (N=2). Finalmente, los animales fueron sacrificados para extraer muestras de tejido cardiaco y estudiar la expresión de marcadores del sistema de conducción cardiaco, para evaluar posibles alteraciones moleculares o morfológicas de la IT.

Tras la implantación del filtro IVC, se confirmó en todos los animales la generación de la IT, observándose una regurgitación valvular hacia la AD seguida de un aumento significativo de la FC, así como la dilatación de AD y VD. En los animales con IT de 60 días se detectaron alteraciones en el ritmo cardiaco consistentes en taquicardia auricular multifocal y taquicardia ventricular no sostenida.

En el tejido cardiaco de los animales con IT se confirmó la hipertrofia celular y un aumento significativo de la fibrosis en la AD y el nodo sinusal (NS) mediante análisis histológico (hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson). Estas alteraciones se correspondieron con un aumento en la expresión y distribución de marcadores del sistema de conducción cardiaca HCN4 y CNTN2 observados por inmunofluorescencia, especialmente en grupos de células de la AD aisladas por fibras de colágeno. En el mismo sentido, se comprobó la sobreexpresión en la AD y NS de las proteínas de uniones GAP CX43 y CX45 en la AD y el NS. Estas uniones son importantes en la conducción eléctrica intercelular y junto con las alteraciones de HCN4 podrían ser el origen de las alteraciones del ritmo cardiaco observadas en el modelo experimental.

Finalmente, se estudió la ruta de TGF-β por su papel regulador de estas proteínas en el tejido cardiaco, donde observamos no solo una correlación positiva entre la expresión de TGF-β y las proteínas de uniones GAP, sino también de sus mediadores SMAD2-3 y SMAD4. Todos estos factores nos pueden indicar que esta ruta puede estar favoreciendo al inicio y la progresión de la patología.

Con respecto a la aplicabilidad de los resultados, consideramos que, debido a la falta de modelos animales, no es posible estudiar las bases moleculares subyacentes a la patología o testar nuevos tratamientos. De ahí la relevancia del modelo porcino de IT que hemos generado, ya que permite describir la firma molecular asociada a la IT.

dianas 13(1) > Alcharani etal

dianas | Vol 13 Num 1 | marzo 2024 | e202403x010

Terapia Celular basada en el uso de hPMSCs como inductor de miRNAs cardioprotectores tras un Infarto Agudo de Miocardio.

Nunzio Alcharani, Laura Tesoro, Javier Diez-Mata, Ignacio Hernandez, Rafael Ramirez-Carracedo, Beatriz Jiménez-Guirado, Claudia González-Cucharero, Laura Botana, Marta Saura, Maite Iglesias, Carlos Zaragoza

Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria - Universidad Francisco de Vitoria.

a. nunzio.alcharani@ufv.es; nunzioalcharani@gmail.com

IX Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2024.
XVIII Simposio de Dianas Terapéuticas.
18 a 22 de marzo, 2024. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Terapia Celular; Cardiologia; miRNAs; Infarto

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) siguen siendo la principal causa de morbimortalidad. Entre estas afecciones, el infarto agudo de miocardio (IAM) destaca como la más crítica, cuya resolución termina ocasionado insuficiencia cardiaca o fallecimiento. La gravedad de esta patología en la salud refleja la importancia, no solo de mejorar su prevención sino de mejorar su tratamiento, con enfoques más específicos y novedosos. Dentro de este marco, nuestro grupo de investigación ha demostrado una amplia experiencia particularmente en el desarrollo de enfoques terapéuticos innovadores. En este contexto, las terapias celulares han surgido como una estrategia prometedora para mejorar la recuperación del tejido cardiaco después del padecimiento del IAM. Dentro de todas ellas, el uso de células madre mesenquimales (MSC) ha sido aplicado en múltiples ensayos clínicos demostrando una mejora sustancial del tejido cardiaco mediante la liberación de factores paracrinos. Dentro de este tipo celular, las MSC derivadas de placenta humana (hPMSC) resultan de gran interés debido a su plasticidad fenotípica, capacidad de migración y un contrastado potencial regenerativo, donde, además, su utilización está fuera del debate ético lo que las hace candidatas ideales para su aplicación. No obstante, su uso no ha sido testado aún en IAM. Considerando el potencial terapéutico de las hPMSC y su gran tropismo hacia sitios de lesión cardiovascular, hipotetizamos que la administración de hPMSC tras un proceso de isquemia miocárdica podría inducir una respuesta positiva en la mejora del remodelado cardiaco. El objetivo principal de nuestro estudio consiste en validar el efecto cardioprotector de las hPMSC en el contexto de IAM. Utilizando un modelo murino de isquemia/reperfusión miocardica (IR) inducida mediante ligamiento de la arteria coronaria descendente anterior, testamos los efectos de las hPMSC mediante su administración a los 2 días, teniendo como punto final los 21 días post-IAM. Para ello, se evaluaron diferentes parámetros cardiacos mediante ecocardiografía, destacando la medición de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) a nivel basal, post-IAM, semanalmente, y a punto final. Tras el sacrificio de los animales, los corazones fueron destinados a su análisis histológico para determinar la extensión de las zonas de inflamación, necrosis, y fibrosis
El tratamiento con hPMSC indujo cardioprotección en los animales sometidos a IAM, mostrando recuperación de la FEVI, reducción de la inflamación y de la fibrosis. Considerando que sus efectos proceden de mecanismos paracrinos, evaluamos la capacidad de las hPMSC para liberar factores favorables para el remodelado cardiaco y su forma de transporte, verificando que esta se daba por vía exosomal.
Identificamos miR-150 como un mediador crucial en la protección cardiaca, detectando su sobreexpresión tanto en plasma como en el tejido de los animales tratados con hPMSC. Además, evaluamos parte de la ruta reguladora de este miRNA detectando la disminución de la proteína HOXA4 dependiente del LncRNA MIAT, habitualmente asociada con un remodelado cardiaco anómalo. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las células HPMSC son capaces de generar una recuperación del tejido infartado de forma independiente a su anidación en él, actuando por vía exosomal mediante la regulación del eje MIAT/miR-150/HOXA4.
Actualmente, mediante el uso de CRISPR/Cas9 con acción doble frente el precursor de miR-150, pretendemos generar hPMSC knock out para miR-150, pudiendo validar de esta forma que el efecto positivo de estas MSC se corresponde a miR-150. Nuestras futuras líneas de investigación pretenden ahondar en el estudio de la capacidad de estas células para inducir regulación, pudiendo dar el salto a futuros ensayos clínicos en los que por fin la terapia celular sea una línea de tratamiento efectivo para tratar la mayor causa de fallecimiento mundial.

dianas 13(1) > Hernández etal

dianas | Vol 13 Num 1 | marzo 2024 | e202403x009

CAP-1 como nueva diana molecular en la aterosclerosis asociada a la senescencia endotelial.

Ignacio Hernández, Rafael Ramírez-Carracedo, Laura Tesoro, Javier Diez-Mata, Laura Botana, Nunzio Alcharani, Beatriz Jiménez-Guirado, Claudia González-Cucharero, Marta Saura, Jose Luis Zamorano, Carlos Zaragoza

Unidad Investigación Cardiovascular UFV/H. Hospital Ramón y Cajal.

a. ignacio.hernandez@ufv.es

IX Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2024.
XVIII Simposio de Dianas Terapéuticas.
18 a 22 de marzo, 2024. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Senescencia Endotelial; Aterosclerosis; Disfunción Endotelial; CAP1; PCSK9

Resumen

Introducción: La disfunción endotelial (DE) es clave en el desarrollo de las enfermedades cardiovasculares, afectando a un tercio de personas menores de 70 años. La senescencia endotelial (SE), vinculada al envejecimiento es origen de cualquier patología cardiovascular. La SE induce un patrón secretor asociado a la senescencia (SASP), incluyendo la secreción de vesículas extracelulares (VEs), específicamente VE endoteliales (VEE). La liberación de VEE se traduce incrementado el desequilibrio entre la producción de Óxido Nítrico (NO) y ROS. La Proteína Asociada a la Ciclasa 1 (CAP-1) está vinculada a la regulación de la dinámica del citoesqueleto, actuando como una proteína de recubrimiento de filamentos de actina. Por lo tanto, CAP-1 desempeña un papel crucial en la migración e invasión celular, procesos esenciales fisiológicos y patológicos de la aterosclerosis. De hecho, CAP-1 es un componente recientemente reconocido en la orquestación del metabolismo del colesterol al interactuar con PCSK9, influyendo en la progresión aterosclerótica.
Hipótesis: Hipotetizamos que la comprensión de la firma molecular de las VEE y la funcionalidad de CAP-1 podría ser crucial para mejorar la prevención de enfermedades cardiovasculares.
Metodología: Se aislaron VEE del plasma de ratones ApoE-/- con aterosclerosis, provenientes de animales jóvenes (8 semanas) y envejecidos (24 semanas) a los cuales se les administró dieta alta en grasa durante 12 semanas. Posteriormente, se aisló la aorta para su valoración con Oil Red O y se analizó la carga de estas VEE, empleándolas para inducir senescencia en las líneas celulares de aorta humana (HAEC) y coronaria humana (CAEC), explorando su relación con la edad y los marcadores de inflamación mediante inmunoblot e inmunofluorescencia. Se evaluó la actividad de CAP-1 mediante su silenciamiento (siRNA) y su sobreexpresión (plásmido) en el endotelio vascular, utilizando la actividad de la β-galactosidasa como indicador de envejecimiento.
Resultados: Evidenciamos una mayor formación de placas de ateroma en ratones ApoE-/- viejos en comparación con los jóvenes tras 12 semanas de dieta grasa. El análisis proteómico del SASP indicó un aumento significativo de marcadores relacionados con la adhesión, proteasas de la matriz extracelular y componentes relacionados con el envejecimiento en las EVs envejecidas, incluida la presencia de CAP-1. La relevancia de CAP-1 se evidenció al reducir la SE en células endoteliales silenciadas con siRNA CAP-1, mientras que, inversamente, la sobreexpresión de CAP-1 indujo un efecto opuesto, restaurando parcialmente la SE. Para probar si las VEE circulantes de ratones ateroscleróticos inducen ES, cultivamos y tratamos HAEC y CAEC en las que la SE se incrementó con las vesículas aisladas de ratón viejo. Asimismo, se acompañó con un aumento del ratio BH2/BH4, explicando en conjunto el desacoplamiento de eNOS a favor de la producción de ROS y peroxinitrito, creando un entorno inflamatorio, como se confirmó por los niveles de CypA y su receptor EMMPRIN.