dianas 7(2) > Rodríguez-Alonso y Martínez-Botas-Mateo

dianas | Vol 7 Num 2 | septiembre 2018 | e20180907

Puesta a punto de un microarray basado en el sistema piezoeléctrico para pronosticar la eficacia y seguridad del tratamiento de la alergia a las proteínas de leche de vaca mediante inmunoterapia oral.

Alberto Rodríguez Alonso^1, a, Javier Martínez-Botas Mateo²

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Servicio de Bioquímica-investigación, Hospital Universitario Ramón y Cajal, IRYCIS, Madrid, España.

a. albertoroal7511@hotmail.com

Palabras clave: alergia a leche de vaca; microarray; biomarcador; péptido; impresión piezoeléctrica

Resumen

La alergia a la leche de vaca es una de las alergias más frecuentes en la edad pediátrica, afectando aproximadamente al 2.5% de los niños menores de dos años. Actualmente se está implantando un tratamiento denominado inmunoterapia oral a la leche de vaca (ITO) con objeto de conseguir desensibilizar a los pacientes y así, mejorar su calidad de vida. Sin embargo, este tratamiento no está exento de riesgos y requiere del desarrollo de nuevos biomarcadores para predecir su eficacia y seguridad y así poder hacer extensible este tratamiento a más pacientes. En un estudio previo, el grupo investigador de la Unidad de microarrays del Hospital Universitario Ramón y Cajal encontró un conjunto de 27 péptidos que permitía predecir, antes del inicio del tratamiento, la respuesta de los pacientes a la ITO. El objetivo del presente trabajo ha sido la puesta a punto de un nuevo sistema de impresión de microarrays basado en tecnología piezoeléctrica, que permita en un futuro el desarrollo de un dispositivo para la detección estos biomarcadores con mayor eficacia y versatilidad que el sistema utilizado con anterioridad. Para ello, se probaron diferentes tampones de impresión (sciSPOT Protein D1 y D11 de Scienion y Protein Printing Buffer de ArrayIt) y diferentes soportes (cristal, placa y membrana de nitrocelulosa). Los resultados mostraron que el Protein Printing Buffer de ArrayIt es el tampón más adecuado y que los tres soportes son válidos para la detección de proteínas y péptidos biomarcadores. Por último, se analizó mediante microarrays en cristal y placa el suero de 7 pacientes alérgicos antes de ser sometidos a ITO con leche de vaca. Los resultados obtenidos mostraron diferentes patrones de reconocimiento por parte de los pacientes. Actualmente estamos pendientes de poder correlacionar estos resultados con el resultado de la ITO.

dianas 7(2) > Tosat-Bitrián etal

dianas | Vol 7 Num 2 | septiembre 2018 | e20180906

Biosensores específicos basados en quantum dots en la detección de proteínas patológicas en ELA.

Carlota Tosat Bitrián, Ana Martínez, Valle Palomo

1. 1Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Grupo de Química Médica y Biología Traslacional, Centro de Investigaciones Biológicas- CSIC, Madrid, España.

a. carlotatbitri@gmail.com

Palabras clave: ELA; quantum dot; patología molecular; célula única; TDP-43

Resumen

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la muerte de las motoneuronas (MN) lo cual produce una parálisis progresiva. El mecanismo subyacente a dicha muerte selectiva de las motoneuronas todavía no se ha caracterizado, convirtiéndose en una diana crucial para el desarrollo de fármacos innovadores y efectivos. Con el objetivo de caracterizar la patología molecular, se propone realizar un análisis de perfil molecular a nivel de célula única. Como herramienta para analizar diferentes dianas moleculares, se han utilizado quantum dots (QDs) conjugados con anticuerpos monoclonales. Los QD son nanopartículas formadas por un núcleo de CdSe y una cubierta de ZnS que ofrecen propiedades fotoluminiscentes únicas. Presentan una alta fotoestabilidad, altos coeficientes de extinción, amplios espectros de absorción pero estrechos de emisión lo cual permite una detección más sensible así como ensayos multiplex. Conjugando los QD con distintos anticuerpos monoclonales se propone implementar un inmunoensayo basado en QD que permita estudiar a nivel de célula única distintas proteínas diana implicadas en la patología molecular del ELA como la proteína nuclear TDP-43. Se ha visto que las MN afectadas presentan agregados de p-TDP-43 en el citosol que inducen por distintos mecanismos la apoptosis de las MN. Es por ello que resulta crucial determinar la etiología de estas inclusiones y caracterizarlas molecularmente. En este trabajo se muestran los primeros resultados de la implementación del inmunoensayo basado en QD en células SH-SY5Y. Posteriormente, el objetivo final es aplicar este inmunoensayo en modelos de MN humanos para determinar cambios en las proteínas clave tras el tratamiento con candidatos terapéuticos ayudando a su selección.

dianas 7(2) > Elvira-Blázquez etal

dianas | Vol 7 Num 2 | septiembre 2018 | e20180905

Purificación y estudio de la actividad enzimática de las superóxido dismutasas glicosomales de Leishmania infantum

Daniel Elvira Blázquez, Juan Carlos García Soriano, Héctor Elessar de Lucio Ortega, Antonio Jiménez Ruíz

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. antonio.jimenez@uah.es

Palabras clave: leishmaniosis; Leishmania infantum; glicosoma; SODB1; SODB2; IMAC

Resumen

La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria causada por especies del género Leishmania, unos protozoos flagelados que infectan los macrófagos de sus hospedadores vertebrados. Estos parásitos son capaces de sobrevivir al estrés oxidativo del fagolisosoma gracias a un conjunto de enzimas antioxidantes, entre las que se encuentra la superóxido dismutasa (SOD). La SOD es una enzima dimérica capaz de dismutar los radicales superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno. En Leishmania, a diferencia del ser humano, las SODs poseen como cofactor un átomo de hierro. Estos parásitos poseen 4 isoformas de la SOD: dos glicosomales (SODB1 y SODB2) y dos mitocondriales (SODA y SODC). Los glicosomas son unos orgánulos que compartimentan una gran variedad de rutas metabólicas en estos parásitos. Algunas de ellas, como la β-oxidación de ácidos grasos, generan especies reactivas de oxígeno (ROS), entre los que se encuentran los radicales superóxido, que son retirados de los glicosomas gracias a SODB1 y SODB2. Algunos autores han demostrado que el knock-down simultáneo de ambas enzimas en Trypanosoma brucei reduce drásticamente la supervivencia de estos parásitos. Por estos motivos, SODB1 y SODB2 podrían ser unas buenas dianas terapéuticas. En este trabajo hemos realizado el clonaje de los genes que codifican las enzimas SODB1 y SODB2 de Leishmania infantum con objeto de expresar estas proteínas unidas a una etiqueta molecular de 6 histidinas que permite su purificación mediante una cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC). Nuestro trabajo permite concluir que la expresión óptima de His6-SODB1 se obtiene tras una inducción de 2 horas a 16ºC. En el caso de His6-SODB2 los mejores resultados se obtuvieron tras 4 horas a 16ºC. Las proteínas SODB1 y SODB2 escindidas de su tag His6 presentaron una pureza de un 97.4% y un 93.9%, respectivamente. Finalmente, se realizó un ensayo de actividad con el que se confirmó que ambas enzimas son funcionales.

dianas 7(2) > Gutiérrez-Tejedor etal

dianas | Vol 7 Num 2 | septiembre 2018 | e20180904

Papel neuroprotector y antiinflamatorio de compuestos derivados de la triptamina en un modelo in vitro de enfermedad de Parkinson.

Daniel Gutiérrez Tejedor, Ana Pérez-Castillo, José Ángel Morales-García

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Departamento de Modelos Experimentales de Enfermedades Humanas, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (CSIC-UAM), 28029 Madrid, España.  3. Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), 28031 Madrid, España.  4. Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina, UCM, Plaza Ramón y Cajal s/n, 28040 Madrid, España.

a. danielgutierreztejedor@gmail.com

Palabras clave: enfermedad de Parkinson; neuroprotección; inflamación; ayahuasca; derivados triptamínicos; antagonistas

Resumen

La enfermedad de Parkinson se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la parte compacta de la sustancia negra en el mesencéfalo ventral y por la neuroinflamación generada por la glía colindante, lo cual altera la ruta de comunicación nigroestriatal y produce los síntomas motores característicos de la enfermedad. Recientemente, se han descrito posibles efectos terapéuticos en un brebaje utilizado en ritos chamánicos por tribus del Amazonas: la ayahuasca. A partir de uno de los principales componentes de la ayahuasca se han desarrollado derivados químicos con potenciales propiedades terapéuticas. El objetivo de este estudio es analizar si cuatro de dichos derivados tienen propiedades neuroprotectoras y antiinflamatorias en un modelo in vitro de enfermedad de Parkinson y determinar a través de qué receptor ejercerían tales efectos terapéuticos. Los resultados de los ensayos neuroprotección en la línea celular dopaminérgica SH-SY5Y frente a un daño inducido por 6-hidroxidopamina demostraron que los cuatro derivados estudiados ejercían un importante papel neuroprotector y antiinflamatorio. En cultivos primarios de astroglía y microglía estimulados con lipopolisacárido bacteriano también se observó un claro efecto antiinflamatorio por parte de los derivados analizados, con una reducción significativa de los niveles de TNFα, COX-2 y nitritos producidos por la glía. Se determinó además que dichos efectos neuroprotectores y antiinflamatorios podrían estar mediados a través del receptor Sigma-1 en dos de los cuatro derivados analizados. En el caso de los otros dos derivados, nuestros resultados no determinaron con exactitud a través de qué receptor podrían estar actuando. En futuros estudios habrá que determinar si estos compuestos podrían mediar estos efectos a través de otros receptores, completar los resultados de neuroprotección con ensayos de citotoxicidad, comprobar si pueden atravesar la barrera hematoencefálica y realizar ensayos in vivo para confirmar el papel neuroprotector y antiinflamatorio de los derivados más eficaces.

dianas 7(2) > González-Martínez y Miravalles-Cornejo

dianas | Vol 7 Num 2 | septiembre 2018 | e20180903

Desarrollo de un sistema de Análisis de Peligros y Puntos de Control Críticos (APPCC) en la cocina hospitalaria.

Lucía González Martínez, Alejandro Miravalles Cornejo

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. APPCC-consulting, Madrid.

a. luxia_gm@hotmail.com

Palabras clave: enfermedades alimentarias; seguridad alimentaria; sistema APPCC; cocina hospitalaria; puntos de control críticos

Resumen

Las enfermedades alimentarias transmitidas al ser humano tienen una gravedad mundial y su causa principalmente son microorganismos. En respuesta al elevado número de estas enfermedades se ha establecido un sistema para controlar y mejorar la seguridad alimentaria denominado Sistema de Análisis de Peligros y Puntos de Control Críticos (APPCC). Este sistema se hizo obligatorio en España en 1996 para todos los sectores alimentarios, tanto empresas de alimentos como restaurantes o cocinas hospitalarias. Dado que los pacientes hospitalizados son personas más vulnerables al contagio de microorganismos patógenos y a padecer otras enfermedades, en el siguiente trabajo se desarrolla un sistema APPCC para la cocina hospitalaria siguiendo los siete principios de dicho sistema descritos en el Codex Alimentarius con el fin de analizar los posibles puntos de control críticos (PCC) y desarrollar unas medidas preventivas y correctivas para evitar posibles enfermedades. Para ello, se realizó un diagrama de flujos donde se detallaron las fases por las que pasan los alimentos, los posibles peligros biológicos, químicos y físicos en dichas fases y la identificación de los puntos de control críticos siguiendo el árbol de decisiones. Como resultado se han descrito un total de cinco puntos de control críticos, todos ellos relacionados con la temperatura y su efecto perjudicial principalmente en la contaminación biológica del producto. Además, se han descrito las medidas preventivas para todos los posibles peligros analizados y las medidas correcticas para aquellos PCC. Se espera que tras la implantación de este sistema en la cocina hospitalaria se consiga una adecuada calidad alimentaria y que el personal manipulador sea consciente de la importancia de realizar unas buenas prácticas de manipulación para evitar posibles enfermedades alimentarias.

dianas 7(2) > Sandoica-Expósito etal

dianas | Vol 7 Num 2 | septiembre 2018 | e20180902

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células de cáncer de próstata LNCaP.

Rebeca Sandoica Expósito, Alicia Bort Bueno, Belén Sánchez Gómez, Pedro A. Mateos Gómez, Inés Díaz-Laviada, Nieves Rodríguez Henche

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. rebecca.sandoica@gmail.com

Palabras clave: VEs; exosomas; aislamiento; caracterización; cáncer próstata

Resumen

La comunicación entre células mediante secreción de vesículas ha tenido un interés creciente en las últimas décadas. Los exosomas son VEs pequeñas secretadas por las células de forma fisiológica y patológica. En el cáncer de próstata, los exosomas liberados por las células tumorales contienen un conjunto de moléculas específicas relacionadas con el tumor. Por ello, los exosomas han aparecido como una nueva fuente de biomarcadores de cáncer. El objetivo principal de este trabajo es la optimización del protocolo de aislamiento de exosomas de células de cáncer de próstata, y la caracterización de los mismos. Los resultados indicaron que, a pesar de haber conseguido mejoras en el método de aislamiento, la obtención de exosomas puede resultar en el co-aislamiento con otras VEs de tamaño similar no exosómicas. No obstante, el enriquecimiento de marcadores específicos de exosomas en las VEs aisladas indicó la presencia de estas vesículas. De entre todos los marcadores de cáncer de próstata, PSMA podría considerarse un biomarcador exosómico para el diagnóstico del cáncer de próstata. De cualquier manera, los biomarcadores exosómicos se encuentran todavía en etapa de descubrimiento, pero su potencial en el diagnóstico clínico espera ser explotado por completo. Por ello, es necesario un refinamiento de la purificación y el análisis de los subtipos de VEs.

dianas 7(2) > Calvo-Serrano etal

dianas | Vol 7 Num 2 | septiembre 2018 | e20180901

Estudio de los efectos de la inhibición de la vía del mevalonato en la proliferación celular.

Silvia Calvo Serrano, Gema de la Peña, Miguel Ángel Lasunción

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Servicio de Bioquímica-Investigación, Hospital Universitario Ramón y Cajal, IRyCIS, Madrid y CIBER de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición.

a. silcalser@gmail.com

Palabras clave: Mevalonato difosfato descarboxilasa; HMG-CoA reductasa; mevalonato; ATP; HL-60

Resumen

El colesterol es un esterol de gran relevancia para la supervivencia celular y la falta sostenida del mismo supone un estrés que produce la interrupción del ciclo celular. En su biosíntesis interviene un gran número de enzimas. El mevalonato, intermediario generado por acción de la HMG-CoA reductasa, se fosforila y por acción de la mevalonato difosfato descarboxilasa (MVD) se transforma en isopentenil difosfato (IPP) con gasto adicional de ATP. La inhibición experimental de esta enzima en ausencia de colesterol en células deficientes de p53 produce una parada del ciclo en fase S por deficiencia de dNTPs. Los dNTPs son sintetizados por la ribonucleótido reductasa (RNR), que tiene como activador al ATP. En el presente trabajo nos propusimos estudiar los efectos sobre la proliferación, el tamaño, el ciclo celular y la homeostasis del ATP intracelular, causados por la inhibición de la MVD, la HMG-CoA reductasa y la ATP sintasa, en células HL-60, para establecer una relación entre el gasto de ATP en la ruta del mevalonato y la interrupción de la síntesis de ADN durante la fase S del ciclo. Hemos observado que la inhibición de la MVD produce un descenso de la proliferación y un aumento del tamaño celular debido a la parada del ciclo celular en fase S, que podría estar relacionada con el descenso de las concentraciones intracelulares de ATP observado en estas células y el consiguiente estrés replicativo. Esta situación se agrava suministrando mevalonato y se revierte parcialmente limitando el aporte de mevalonato por inhibición de la HMG-CoA reductasa.