dianas 9(1) > Escobar etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003b10

Indoxil sulfato induce senescencia y liberación de microvesículas en células endoteliales que promueven la calcificación vascular.

Beatriz Escobar, Guillermo Bodega, Julia Carracedo, Rafael Ramírez, Matilde Alique

1. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid, Spain.  2. Departamento de Biomedicina y Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid, Spain.  3. Departamento de Fisiología Animal (II), Facultad de Biología, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Spain.  4. Institute of Investigation, Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain.

a. beatriz.ed98@gmail.com

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: senescencia; microvesículas; calcificación vascular; células endoteliales; toxinas urémicas

Resumen

Antecedentes: Tanto los ancianos como los pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) tienen una mayor probabilidad de sufrir enfermedades inflamatorias cardiovasculares (EICVs), las cuales pueden asociarse a la calcificación vascular como inicio de las mismas. Las células endoteliales tienen una senescencia prematura como mecanismo fisiopatológico en la ECV asociada a ERC. Hemos demostrado que las microvesículas (MVs) producidas por estas células senescentes, debido a su capacidad de comunicación intercelular, pueden iniciar dicha calcificación. Además, las toxinas urémicas, como el indoxil sulfato (IS), que se relacionan con la ERC, también pueden generar una senescencia endotelial precoz, lo que puede secretar MVs que inicien la calcificación vascular. Todo esto permite que las MVs puedan ser útiles para su caracterización como biomarcadores tempranos y/o diana terapéutica en estas patologías.

Materiales y métodos: Se trataron células endoteliales (HUVEC) con IS. La senescencia se cuantificó por el método de β-galactosidasa. Por citometría de flujo se aislaron y se caracterizaron las MVs producidas por las HUVEC senescentes, y se utilizaron para el tratamiento de células musculares lisas (HASMC) durante 9, 20 y 30 días. En HASMC se valoraron los depósitos de calcio por el colorante rojo alizarina. A los 30 días, mediante el kit de fenolsufoneftaleina, se cuantificó el contenido de calcio. Mediante PCR cuantitativa se determinó en HASMC la expresión de genes pro-calcificantes y por western blot la expresión de un marcador específico de HASMC (SM22α).

Resultados: El tratamiento con IS indujo senescencia precoz en HUVEC (control: 7,07±2,87% vs. IS: 72,90±13,09%, p<0.0001) y se observó un incremento en la producción de MVs (control: 1,68±1.00 vs. IS: 9.92±4,29 MVs/célula, p<0.005). Las MVs procedentes de células con senescencia precoz por el efecto del IS indujeron calcificación en HASMC, en un proceso asociado a desregulación en la expresión de genes procalcificantes (Runx2, BMP2). Además, las MVs generadas en HUVEC tratadas con IS producen un proceso de desdiferenciación de las HASMC (expresión de SM22α).

Conclusión: Las células endoteliales que tienen una senescencia precoz como consecuencia del estrés oxidativo generado por las toxinas urémicas son capaces de producir MVs que promuevan la calcificación vascular. Su cuantificación en plasma permite que se pueda utilizar como biomarcador para valorar la progresión de la enfermedad en sujetos susceptibles y para diseñar dianas terapéuticas que eviten la generación o la presencia en el espacio extracelular de MVs procalcificantes.

dianas 9(1) > Figuer etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003b09

Senescencia celular acelerada en pacientes con enfermedad renal crónica.

Andrea Figuer, Nadia Serroukh, Gema Valera, Noemí Ceprián, Enrique Morales, Matilde Alique, Julia Carracedo

1. Universidad Complutense de Madrid, Departamento de Medicina.  2. Universidad Complutense de Madrid, Departamento de Fisiología.  3. Universidad de Alcalá, Departamento de Biología de Sistemas.

a. andrea.figuer25@gmail.com; afiguer@ucm.es

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Senescencia; Enfermedad Renal Crónica; Diálisis; Trasplante renal; Perfil Secretor Senescente

Resumen

Los pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) se caracterizan por un deterioro renal, que tiene como consecuencia la acumulación de toxinas urémicas. Estos pacientes presentan un envejecimiento acelerado (EA), posiblemente asociado con una edad biológica superior a la edad cronológica. El EA de los pacientes con ERC está relacionado con alteraciones fenotípicas y funcionales del sistema inmunitario. La desregulación inmunitaria tiene como consecuencia un empeoramiento de la calidad de vida de los pacientes con ERC, con un mayor deterioro vascular que provoca un aumento de la incidencia de accidentes cardiovasculares. El EA se atribuye a la acumulación de toxinas urémicas, que son responsables de un aumento de citoquinas proinflamatorias aumentando el estrés oxidativo y ocasionando una inflamación crónica subclínica1. El EA está asociado a un fenotipo celular secretor senescente (SASP), que consiste en la secreción de distintos productos por parte las células senescentes, entre los que se incluyen que conduce a que citoquinas proinflamatorias (IL-6, TNF-α…), quimioquinas, factores de crecimiento y factores angiogénicos2. La presencia de SAPS está relacionada con alteraciones en el microambiente tisular, aumento de la infiltración leucocitaria y malignificación celular3. Asociado a este SASP, las células inmunitarias sufren cambios, por ejemplo, se asocia con una pérdida de la función tímica y la expansión de la población de células T de memoria, y un incremento proporcional de los linfocitos T CD8 con actividad citotóxica4.
En un estudio observacional transversal llevado a cabo en pacientes con ERC avanzada en diferentes modalidades de tratamiento renal sustitutivo (conservador, hemodiálisis, diálisis peritoneal y trasplante), hemos observado una disminución significativa de los linfocitos T CD4 con respecto a los individuos sanos, siendo especialmente relevante este descenso en pacientes en hemodiálisis. Esto supuso una inversión en el cociente de CD4+/CD8+, característica que también se observa en personas con edad avanzada. Además, iba asociado a un descenso en el porcentaje de linfocitos B5. Sin embargo, no se observaron cambios en las concentraciones de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA), ni en factores del complemento (C3, C4). En conclusión, nuestros resultados muestran un estado de inmunodeficiencia en pacientes con ERC en todas las modalidades de tratamiento renal sustitutivo, que podría estar íntimamente relacionado con el EA asociado a estos pacientes. Estos parámetros pueden ser usados como biomarcadores de complicaciones patológicas en los pacientes con ERC y podrían modularse de forma que se pueden establecer como dianas terapéuticas de seguimiento diagnóstico para establecer tratamientos que puedan revertir y/o prevenir el EA en ERC.

1. Kooman, J. P., Kotanko, P., Schols, A. M. W. J., Shiels, P. G., & Stenvinkel, P. (2014). Chronic kidney disease and premature ageing. Nature Reviews Nephrology, 10(12), 732–742. doi:10.1038/nrneph.2014.185


2. Wang, W., Cai, G. & Chen, X. (2017), Cellular senescence, senescence-associated secretory phenotype, and chronic kidney disease", Oncotarget, vol. 8, no. 38, pp. 64520-64533.


3. Dai, L., Qureshi, A.R., Witasp, A., Lindholm, B. & Stenvinkel, P. (2019), Early Vascular Ageing and Cellular Senescence in Chronic Kidney Disease, Computational and Structural Biotechnology Journal, vol. 17, pp. 721-729


4. Betjes, M. G., & Litjens, N. H. (2014). Chronic Kidney Disease and Premature Ageing of the Adaptive Immune Response. Current Urology Reports, 16(1). doi:10.1007/s11934-014-0471-9


5. Pahl MV, Gollapudi S, Sepassi L, Gollapudi P, Elahimehr R, Vaziri ND. (2010) Effect of end-stage renal disease on B-lymphocyte subpopulations, IL-7, BAFF and BAFF receptor expression. Nephrol Dial Transplant. 25(1):205–212. doi:10.1093/ndt/gfp397

dianas 9(1) > Campillo etal

dianas | Vol 9 Num 1 | marzo 2020 | e202003b08

La formación de podosomas y la adhesión de leucocitos es mediada por la Quinasa Ligada a Integrinas en la enfermedad renal crónica (ERC).

Sofía Campillo, Lourdes Bohorquez, Elena Gutiérrez-Calabrés, Diego García- Ayuso, David Vaillo, Mercedes Griera, Sergio de Frutos, Manuel Rodríguez-Puyol, Diego Rodríguez-Puyol, Laura Calleros

1. Departmento de Biología de Sistemas, Unidad de Fisiología, Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Instituto Ramón y Cajal de Investigaciones Sanitarias (IRYCIS), Fundación Renal Iñigo Álvarez de Toledo (FRIAT), REDinREN del Instituto de Salud Carlos III, y NOVELREN de la Comunidad de Madrid, Madrid, España.  3. Fundación para la Investigación Biomédica, Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá de Henares, Madrid, España.  4. Unidad de Nefrología del Hospital Universitario Príncipe de Asturias y Departamento de Medicina de la Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. sofia.campillo@edu.uah.es  b. lourdes.bohorquez@uah.es  c. elena.gutierrez@edu.uah.es  d. diegogarcia2195@gmail.com  e. david.vaillo@uah.es  f. mercedes.griera@uah.es  g. sergio.frutos@uah.es  h. manuel.rodriguez@uah.es  i. drodriguez.hupa@gmail.com  j. laura.calleros@uah.es

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Enfermedad Renal Crónica; Enfermedad Cardiovascular; Quinasa Ligada a Integrinas (ILK); podosomas

Resumen

Los pacientes con ERC tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares. Las toxinas urémicas unidas a proteínas, como el p-cresol (pc) y el indoxil sulfato (IS), no se pueden eliminar mediante los métodos de hemodiálisis convencional y producen disfunción endotelial induciendo la adhesión y extravasación de leucocitos al endotelio. Dichos procesos pueden llevarse a cabo mediante estructuras de adhesión dinámicas denominadas podosomas. La quinasa ligada a la integrina (ILK) vincula los receptores de adhesión celular, las integrinas y los factores de crecimiento con el citoesqueleto de actina y con diferentes vías de señalización. El objetivo de este estudio fue investigar la implicación de ILK en la formación de podosomas y la adhesión de leucocitos en condiciones urémicas que simulan la ERC. Los experimentos in vitro se realizaron en la línea celular humana de monocitos, THP-1. Las células fueron incubadas con IS (25 y 100 μg ml^-1) y pc (10 y 100 μg ml^-1) en diferentes tiempos. Se determinaron la viabilidad celular, los niveles de expresión de ILK por Western Blot y RT-qPCR y su actividad quinasa, mediante niveles de fosforilación de P-GSK-3β (Ser9) por Western Blot. Además, ILK fue delecionada con un siRNA específico para analizar la formación de podosomas y la adhesión celular a una matriz de fibronectina, la transmigración de los monocitos y la degradación de la matriz extracelular. También se estudió la colocalización de ILK con cortactina, proteína específica de podosomas. Observamos que las toxinas urémicas no inducen toxicidad en las células THP-1. La actividad de ILK aumentó con el tratamiento de toxinas urémicas a bajas y altas concentraciones, sin cambios en su expresión proteica. La adhesión de los monocitos, la formación de podosomas, la transmigración celular y la degradación de la matriz extracelular fueron significativamente mayores con el tratamiento con toxinas a dosis bajas y altas, mientras que este aumento no se observó con la deleción de ILK. La colocalización de ILK con cortactina confirmó la implicación de ILK en la estructura de los podosomas. Para los experimentos ex vivo, se inyectó tamoxifeno (ratones cKD-ILK) o vehículo (ratones WT) a ratones CRE-LOX, para conseguir la deleción de ILK. Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de los ratones, se trataron con toxinas urémicas y se analizó la adhesión celular a una matriz de fibronectina. En las CMSP de los ratones cKD-ILK se observó una menor adhesión celular, en comparación con los ratones WT, y las toxinas urémicas indujeron un aumento significativo de la adhesión de las CMSP, que fue significativamente menor en las CMSP de los ratones cKD-ILK. Estos datos sugieren que ILK desempeña un papel crítico en los procesos requeridos para la extravasación de leucocitos inducido por la acumulación de las toxinas urémicas y que podría ser una diana terapéutica potencial para el tratamiento del daño vascular asociado con la ERC.