dianas 7(1) > Asenjo-Bueno etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803b11

Efecto de la hiperfosfatemia en la génesis de fibrosis vascular en el envejecimiento.

Ana Asenjo-Bueno, Patricia Sosa, Elena Alcalde-Estévez, Lucía Serrano-García, Patricia Plaza, Diego Rodríguez-Puyol, Gemma Olmos, María Piedad Ruíz-Torres, Susana López-Ongil

1. Servicio de Nefrología y Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá de Henares, España.  2. Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, España.  3. Red Renal (REDinREN), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España.  4. Instituto Reina Sofía de Investigación Renal (IRISIN), Madrid, España.

a. luaasbu19@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B1 – Fisiología

Palabras clave: envejecimiento; hiperfosfatemia; fibrosis vascular; ROS, TGF-β; fibronectina..

Resumen

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO. La hiperfosfatemia aparece secundariamente en los pacientes con enfermedad renal crónica, que presentan complicaciones cardiovasculares asociadas a mayor mortalidad y signos de envejecimiento prematuro. Este estudio plantea establecer la relación entre hiperfosfatemia, envejecimiento y eventos cardiovasculares, evaluando concretamente el desarrollo de fibrosis vascular. MATERIALES Y METODOS. Para ello, se tratan dos tipos celulares básicos en la estructura vascular, células endoteliales (CE) y células musculares lisas (CML) humanas con un donador de fosfato llamado beta-glicerofosfato (BGP), a distintos tiempos. La producción de ROS se analizó por microscopia confocal mediante una sonda fluorescente CellROX. Para los estudios in vivo se utilizaron ratones C57/BL6 jóvenes de 5 meses y viejos de 24 meses. La fibrosis se estudió por la expresión de TGF-ß y fibronectina-1 (FN) por western blot, tanto en células como en tejidos vasculares, y por la tinción de rojo sirio en tejidos. Los niveles de fósforo séricos en ratones fueron determinados por métodos colorimétricos. RESULTADOS. El tratamiento con BGP en CE y CML indujo un aumento en ambas proteínas fibróticas, TGF-ß y FN. Además, se comprobó que el BGP era capaz de aumentar la producción de radicales libres (ROS) a tiempos cortos. Así mismo, se pudo observar que el antioxidante N-Acetil cisteina (NAC) bloqueó los efectos del BGP, sugiriendo que los ROS estaban implicados en la fibrosis inducida por BGP en las células. Se realizaron estudios in vivo en ratones jóvenes y viejos para corroborar los resultados encontrados in Vitro. Los ratones viejos poseían niveles mayores de fósforo sérico respecto a los jóvenes. En general, los ratones viejos presentan mayor grado de fibrosis en diferentes tejidos vasculares como aorta, pulmón y corazón; que fue medida mediante expresión proteica de FN, TGF-ß y por tinción de las fibras de colágeno con Rojo Sirio. DISCUSION. En resumen, podemos concluir que existe una relación entre el envejecimiento y la hiperfosfatemia, siendo ésta una de las posibles causas del desarrollo de fibrosis vascular. Uno de los mecanismos implicados podría ser la mayor producción de ROS por parte del BGP, pero más estudios son necesarios.

dianas 7(1) > Alcalde-Estévez etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803b13

La endotelina 1 induce fibrosis en células de músculo estriado de ratón.

Elena Alcalde Estévez, Ana Asenjo-Bueno, Patricia Sosa, Patricia Plaza, Lucía Serrano, Diego Rodríguez-Puyol, Gemma Olmos, María Piedad Ruíz-Torres, Susana López-Ongil

1. Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, España.  2. Servicio de Nefrología y Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá de Henares, España.  3. Red Renal (REDinREN), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España.  4. Instituto Reina Sofía de Investigación Renal (IRISIN), Madrid, España.

a. elena_22_93@hotmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B1 – Fisiología

Palabras clave: endotelina 1; receptor de endotelina A; fibrosis; músculo esquelético; mioblastos; radicales libres; envejecimiento

Resumen

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO: El envejecimiento se caracteriza por un decline progresivo de las funciones fisiológicas de varios órganos y sistemas. Durante este proceso fisiológico del organismo, se ve alterado el equilibrio de la liberación y/o actividad de las sustancias secretadas por el endotelio, entre las que se encuentra la endotelina 1 (ET-1). La ET-1 es el péptido vasoconstrictor más potente conocido hasta la fecha y se ha descrito que contribuye al desarrollo de fibrosis tisular en distintos tipos celulares. En resultados previos de nuestro grupo de investigación, se ha descrito un incremento de la presencia de fibrosis en el músculo estriado de ratones envejecidos, así como de los niveles de ET-1 circulantes en plasma, en comparación con sus controles jóvenes. Además, se demostró la presencia de receptores para la ET-1 en células murinas de músculo esquelético en cultivo. Por todo ello, el objetivo de este estudio es examinar si la ET-1 puede causar directamente fibrosis en células de músculo esquelético, analizando la expresión de factores fibrogénicos en el cultivo de mioblastos murinos. MATERIALES Y MÉTODOS: Se realizaron experimentos en mioblastos de ratón C2C12 en presencia y ausencia de ET-1 a diferentes tiempos, estudiándose su efecto sobre la expresión de proteínas fibróticas, así como los posibles mecanismos implicados en dicha expresión mediante la administración de diversos inhibidores. El desarrollo de fibrosis se analizó mediante la medición de proteínas fibróticas como fibronectina (FN) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) con las técnicas de western-blot, inmunofluorescencia, RT-qPCR y ELISA. RESULTADOS: La ET-1 induce fibrosis en mioblastos al aumentar la producción de TGF-β y de FN. Los ensayos con antagonistas específicos de los receptores de ET-1, ETA (BQ123) Y ETB (BQ788) confirmaron que el efecto de la ET-1 era mediado por la unión a su receptor ETA y no al receptor ETB. Está descrito que la ET-1 vía receptor ETA activa la vía PI3K-AKT-GSK, que interviene en distintas respuestas celulares. Con el fin de estudiar el mecanismo de acción de la ET-1 sobre la respuesta fibrótica en mioblastos, se demostró la participación de dicha vía mediante la administración de diferentes inhibidores farmacológicos de dicha vía. Además, también se comprobó el papel de la producción de radicales libres (ROS) inducida por ET-1 en la expresión de factores fibróticos mediante la incubación de mioblastos en presencia de antioxidantes (N-acetilcisteína y DPI), observándose que el desarrollo de fibrosis se veía reducido cuando se administraban dichos antioxidantes. DISCUSIÓN: Por tanto, podemos concluir que la ET-1 a través de su receptor ETA posee un efecto directo sobre fibrogénesis en el cultivo de mioblastos mediado por la vía de PI3K-AKT-GSK y la producción de radicales libres. Estos resultados nos sugieren que el aumento de la ET-1 circulante observado durante el envejecimiento sería uno de los factores que influyen en el desarrollo fibrosis en el músculo esquelético.

dianas 7(1) > Sosa etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803b14

La endotelina-1 produce fibrosis y pérdida de función muscular en ratones viejos.

Patricia Sosa, Elena Alcalde, Patricia Plaza, Ana Asenjo, Manuel Rodríguez-Puyol, Gemma Olmos, Susana López-Ongil, María Piedad Ruíz-Torres

1. Universidad de Alcalá, Departamento de Biología de Sistemas, Alcalá de Henares, España.  2. Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario Príncipe de Asturias, Alcalá de Henares, España.  3. RedinRen, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España.  4. Instituto Reina Sofía de Investigación Renal (IRISIN), Madrid, España.

a. patricia.sosacalle@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B1 – Fisiología

Palabras clave: endotelina-1, envejecimiento, fibrosis, función muscular, sarcopenia

Resumen

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO. En estudios previos de nuestro grupo se observó que altas concentraciones de fosfato extracelular inducía senescencia a nivel endotelial a través de un incremento en los niveles de endotelina-1 (ET-1). El objetivo de este estudio es analizar si la fibrosis que da lugar a la pérdida de función muscular en ratones viejos es producida por el aumento de la ET-1 circulante.

MATERIALES Y METODOS. Para este estudio se utilizaron ratones C57/BL6 jóvenes (5 meses) y viejos (24 meses). Todos los ratones fueron alimentados con una dieta normal que contiene un 0.6 % de fósforo. Los ratones viejos fueron divididos en tres grupos a partir de los 21 meses, y siguieron distintas dietas durante los últimos 3 meses: un grupo control que siguió con la dieta normal, otro grupo alimentado con dieta hipofosfatémica conteniendo un 0.2 % de fósforo y otro grupo alimentado con dieta normal más un antagonista de la endotelina, Bosentán 30 mg/Kg/día, disuelto en el agua de bebida. durante los siguiente 3 meses. Los niveles de fósforo y de ET-1 en suero se midieron mediante kits comerciales. Para estudiar la fibrosis se realizaron western-blot de las proteínas pro-fibróticas como TGF-ß y fibronectina (FN), en diferentes músculos, así como la tinción de fibras de colágeno con Rojo Sirio en gemelo y tibial. La pérdida de función muscular se estudió mediante la medida de la fuerza utilizando dos tipos de test: el test de agarre y la electroestimulación percutánea del nervio peróneo común.

RESULTADOS. Se observó un incremento significativo en los niveles de fósforo y de ET-1 séricos en ratones viejos respecto a los jóvenes. Los niveles de fósforo sérico bajaron significativamente en ratones alimentados con la dieta hipofosfatémica, mientras que los valores de ET-1 bajaron tanto en ratones con dieta hipofosfatémica como en ratones tratados con Bosentán. Los niveles de FN en animales viejos aumentaron significativamente con respecto a los jóvenes en cuádriceps y gemelo, este aumento se revierte tras el tratamiento con la dieta baja en fósforo y con el Bosentán. No se observaron cambios significativos en los niveles de TGF-ß. La intensidad de rojo sirio aumenta significativamente en animales viejos y se observa una reversión de la misma en los ratones tratados con dieta hipofosfatémica, pero no en los tratados con Bosentán. Los ratones viejos también mostraron una disminución en la fuerza de las extremidades anteriores, así como una disminución de la fuerza máxima y específica en el músculo tibial con respecto a los ratones jóvenes, estos valores se revirtieron en los ratones con dieta hipofosfatémica.

DISCUSION. Elevados niveles de ET-1 y fosfato sérico producen fibrosis a nivel del músculo esquelético, generando una disfunción muscular que produce un envejecimiento acelerado. Los resultados sugieren que la hiperfosfatemia por sí misma y a través de la inducción de los niveles de ET-1 estaría potenciando la disfunción muscular a través de la aparición de fibrosis, siendo de esta forma, uno de los factores que influyen en la aparición de sarcopenia.

dianas 7(1) > Bernal y Roza

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803b12

Inmunohistoquímica en ganglios de la raíz dorsal transparentes tras marcaje retrógrado de neuromas experimentales en ratón.

Laura Bernal, Carolina Roza

Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. laura.bernal@uah.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B1 – Fisiología

Palabras clave: ganglio de la raíz dorsal; nervio periférico; marcaje retrógrado; inmunohistoquímica; inCLARITY

Resumen

La caracterización molecular de neuronas axotomizadas se realiza generalmente con inmunohistoquímica en secciones congeladas de ganglio de la raíz dorsal y nervio perifério. Esta técnica es tediosa, larga y lleva a la pérdida de información. El uso de microscopía confocal en tejido no-seccionado no es posible debido a la dispersión de la luz, un problema que fue solucionado con el desarrollo de la técnica CLARITY [1]. Desde entonces se han desarrollado numerosos protocolos que tarnsforman tejido intacto en una estructura ópticamente transparente, que en combinación con inmunohistoquímica y marcaje retrógrado, permiten la reconstrucción 3D de tractos neuronales. Nos propusimos adaptar el primer protocolo descrito por uno simplificado, pasivo y de precio reducido (inCLARITY) para estudiar el sistema nervioso periférico. Evaluamos su compatibilidad con diferentes marcadores retrógrados (DiI, Fluoro-gold -FG-, Fluoro-ruby -FR-, Fluoro-emerald -FE- and Retrobeads -RB-) así como con inmunohistoquímica específica contra nociceptores. En ratones adultos se realizó una cirugía en la cual se seccionan dos de las tres ramas periféricas del nervio ciático, que fueron luego introducidas en un tubo para evitar la reinervación. En el extremo cortado se marcó con los diferentes marcadores retrógrados. La incisión se cerró. Dos semanas después los animales fueron perfundidos y el tejido extraido y procesado para cryo-sección (crioprotegido en sacarosa 30% y congelado en OCT) o para transparentación (embebido en una mezcla de acrilamida/bisacrilamida/V-50 durante 4h a 37ºC y después en SDS 8%). En el tejido transparente se realizó inmunohistoquímica en free-floating frente a marcadores de nociceptores (IB4 y CGRP) y fibras periféricas (IB4, PanNav). Nuestros resultados muestran como el protocolo implementado (inCLARITY) funciona perfectamente en ganglios de la raíz dorsal y nervios periféricos en 7-12 días, sin producir cambios en volumen o estructura. Además, todos los marcadores retrógrados fueron compatibles con esta técnica. Al igual que en las crio-secciones, FG marcó muchas células, la mayoría de ellas con citoplasma vacuolado. La tinción de DiI fue pobre para ambos protocolos. FR y FE en crio-secciones solo se visualizaron después de inmunotinción contra el fluoróforo, pero ambas se observaron directamente con inCLARITY. RB se observaron bien y con un fondo muy bajo mediante el uso de ambas técnicas. Además, IB4 y CGRP se observaron claramente en ganglios transparentes. En nervios transparentes, la tinción con IB4 mostró claramente diferencias entre fibras intactas y dañadas y los nodos de Ranvier se identificaron fácilmente con el marcador PanNav. Como conclusión, podemos afirmar que hemos desarrollado con éxito un nuevo protocolo asequible para todos los laboratorios y que hace transparente tejido nervioso periférico. Además, este método presenta varias ventajas en comparación con el procesamiento tradicional. Hemos demostramos su compatibilidad con cinco trazadores retrógrados diferentes utilizados comúnmente en el área de la neurobiología. Además, mostramos cómo es posible realizar inmunotinción para fenotipar diferentes poblaciones neuronales. Con respecto a los nervios periféricos, la inmunohistoquímica en nervios transparentes permite estudiar los cambios morfológicos y moleculares después de la axotomía sin alterar su estructura.

1. Chung K, Wallace J, Kim SY, Kalyanasundaram S, Andalman AS, Davidson TJ, Mirzabekov JJ, Zalocusky KA, Mattis J, Denisin AK, Pak S, Bernstein H, Ramakrishnan C, Grosenick L, Gradinaru V, Deisseroth K. 2013. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. May 16;497(7449):332-7. doi: 10.1038/nature12107.