Dianas 5(2) > Carrión-Marchante etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160909

Estudio de la estabilidad de aptámeros generados frente a la proteína 4E-BP1.

Rebeca Carrión Marchante, Ana García Sacristán, Celia Pinto Díez, María Elena Martín, Víctor M. González

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid.  2. Departamento de Bioquímica-Investigación, Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS, 28034, Madrid, España.

a. rebecacm93@gmail.com

Palabras clave: aptámero; cáncer; estabilidad; SELEX; terapia; 4E-BP1

Resumen

El control de la síntesis de proteínas juega un papel importante en el crecimiento y proliferación celular. En la mayoría de los organismos eucariotas se lleva a cabo una traducción dependiente de cap en la cual el factor eucariótico de iniciación (eIF) 4E juega un papel muy importante. La actividad de este factor está regulada por la proteína 4E-BP1 (proteína de unión a eIF4E), entre otras, cuya fosforilación permite la liberación del factor y su participación en la traducción. La sobreexpresión del factor eIF4E produce irregularidades en el ciclo celular relacionadas con el cáncer, enfermedad que produce 8.2 millones de muertes anuales en el mundo. La actividad reguladora de la proteína 4E-BP1 la convierte en una posible diana terapéutica, por lo que en el laboratorio se seleccionaron tres aptámeros frente a dicha proteína a través del método SELEX. Los aptámeros se conocen como 1R, 1F y 20F y poseen estructuras secundarias complejas y con posibilidad de formación de G-cuádruplex, lo que les confiere una alta estabilidad. Por ello en el presente trabajo se ha ampliado la caracterización estructural y funcional de estos aptámeros mediante parámetros como susceptibilidad a nucleasas, IC50, niveles intracelulares, efecto sobre la síntesis de proteínas y constante de disociación. Los resultados posicionan a los aptámeros 1R y 20F como los más estables y los principales candidatos como potenciales herramientas terapéuticas. Sin embargo, es necesario realizar nuevos experimentos funcionales así como estudiar la especificidad de los aptámeros frente a otras proteínas y otros aspectos importantes para su aplicación clínica.

Dianas 5(2) > Fernández-García etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160908

Puesta a punto y utilización de Leishmania tarentolae como sistema de expresión de proteínas para su posterior purificación y cristalización. Aplicación a la proteína LiEndoG.

Fernando Fernández García, Cristina Oliva Correia, Antonio Jiménez Ruiz

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. fernandofdezgar@gmail.com

Palabras clave: Leishmania tarentolae; Endonucleasa G; LiEndoG; purificación de proteínas

Resumen

La leishmaniosis es considerara por la Organización Mundial de la Salud como una enfermedad desatendida al afectar principalmente a personas en situación de pobreza y con unas condiciones higiénico-sanitarias deficientes, ocasionando entre 20000 y 30000 muertes anuales. Los tratamientos disponibles son escasos y pueden presentar graves efectos adversos, a lo que se suma la aparición de resistencias y la ausencia de vacunas eficaces. Es por ello que el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y compuestos activos es esencial en la lucha contra la enfermedad. Nuestro laboratorio ha identificado que la endonucleasa G de Leishmania infantum (LiEndoG) es vital para el parásito, participando en el proceso de muerte celular programada y jugando un papel dual provida/promuerte. La cristalización de LiEndoG sería muy conveniente para conocer su estructura en detalle y diseñar inhibidores proteicos útiles en terapéutica. Anteriormente se intentó purificar LiEndoG utilizando Escherichia coli como sistema de expresión proteica. Sin embargo, para su obtención se requirieron condiciones desnaturalizantes y una posterior renaturalización, lo que podría ocasionar plegamientos incorrectos y pérdida de actividad enzimática. Es por esto que en este trabajo nos propusimos emplear Leishmania tarentolae como sistema inducible de expresión proteica eucariota por presentar características únicas como introducción de modificaciones postraduccionales o procesamiento de péptidos señal. Con este fin, se diseñaron dos construcciones capaces de integrarse en el genoma de L. tarentolae que, por la adición de tetraciclina al medio, dieran lugar a la expresión de una LiEndoG citoplasmática o secretada, respectivamente. Nuestros resultados demuestran que la utilización de L. tarentolae como sistema de expresión proteica nos permite obtener y purificar una LiEndoG recombinante en condiciones nativas que mantiene su actividad enzimática, mostrando que este método de purificación es mucho más conveniente que el empleado anteriormente en E. coli, si bien aún es necesario más trabajo para optimizar la purificación.

Dianas 5(2) > García-Soriano etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160907

Puesta a punto de ensayos de cuantificación de dimerización y actividad de la superóxido dismutasa de hierro A de Leishmania infantum

Juan Carlos García Soriano, Héctor Elessar de Lucio Ortega, Antonio Jiménez Ruíz

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. antonio.jimenez@uah.es

Palabras clave: Leishmania infantum; superóxido dismutasa; actividad; dimerización; citocromo c; ELISA.

Resumen

Los parásitos del género Leishmania son los agentes causales de la leishmaniasis. Estos parásitos tienen la capacidad de sobrevivir dentro de las vacuolas fagocíticas de los macrófagos a pesar de las condiciones de pH y estrés oxidativo allí generadas. Esta resistencia se debe a diversos mecanismos biológicos que comprenden enzimas de detoxificación de las especies reactivas de oxígeno, entre otras. Estas enzimas son potenciales dianas terapéuticas para el tratamiento de la leishmaniasis. Una de estas enzimas es la superóxido dismutasa que cataliza la dismutación del anión superóxido, una especie reactiva de oxígeno con capacidad de originar otras especies reactivas más tóxicas. Leishmania cuenta con 4 superóxido dismutasas de hierro. La superóxido dismutasa de hierro A (Fe-SODA) se localiza en la mitocondria, lugar de producción endógena de superóxido. Se ha visto que la Fe-SODA se sobrexpresa en las formas parasitarias que infectan los macrófagos y que protege de la muerte celular inducida por el tratamiento con miltefosina. En este trabajo se ha clonado, expresado y purificado la Fe-SODA de Leishmania infantum con dos “etiquetas” (tags) moleculares distintas que permiten generar una versión heterodimérica para la puesta a punto de dos ensayos que permitan evaluar la eficacia de compuestos dirigidos contra la enzima. Uno de los ensayos que se ha optimizado en este trabajo ha sido un ensayo de cuantificación de la dimerización basado en la técnica ELISA usando anticuerpos contra las dos etiquetas del heterodímero, uno para pegar a la placa y el otro para evaluar el porcentaje de enzima dimérica. El segundo ensayo está dirigido a medir la actividad catalítica de la enzima. El ensayo de actividad se basa en la producción de superóxido por el sistema xantina/xantina oxidasa y en la competencia por el superóxido entre la Fe-SODA y el citocromo c, una proteína que cambia de color al reducirse por el superóxido.

Dianas 5(2) > Gargantilla-López etal

Dianas | Vol 5 Num 2 | septiembre 2016 | e20160906

Síntesis y evaluación de compuestos con actividad antitumoral derivados de nuevos activadores de AMPK.

Marta Gargantilla López, Sergio Quesada Sánchez, Ana Castro Morera

1. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Instituto de Química Médica, IQM-CSIC. Juan de la Cierva, 3. 28006, Madrid, España.

a. marta.gargantilla@hotmail.com

Palabras clave: oxoindol; antitumorales; cáncer; reprogramación metabólica

Resumen

Además del componente genético, el cáncer se entiende como una enfermedad con un componente metabólico clave a tener en cuenta para poder entender su aparición y su progresión. Las células tumorales pueden sufrir una reprogramación metabólica para adaptarse a las condiciones ambientales en las que se encuentren y no ver afectada su proliferación. Incidir en el equilibrio del metabolismo energético de las células tumorales, alterando farmacológicamente esta capacidad de reprogramación, puede suponer una potente vía para ralentizar su proliferación o incluso ocasionar su muerte. En este sentido, existen fármacos antitumorales cuyos mecanismos de acción están contrastados y consisten en alterar la homeostasis energética de las células proliferativas. Partiendo de las estructuras químicas definidas de estos compuestos, y de prototipos derivados de las mismos, en este trabajo se ha llevado a cabo la búsqueda de estructuras novedosas que puedan tener un efecto antitumoral. A partir de este prototipo se han obtenido compuestos derivados del mismo con una estructura basada en el núcleo de 2-oxoindol en tres pasos de síntesis. Los resultados de este estudio exploratorio han permitido optimizar el rendimiento de reacciones de fluoración, que suponen el último paso de la ruta sintética diseñada, llevando a cabo un estudio exhaustivo de las condiciones experimentales. Además, los ensayos de viabilidad celular incubando diferentes líneas celulares tumorales humanas con los nuevos compuestos obtenidos, ha permitido evaluar el efecto antiproliferativo de los compuestos. La estrecha relación estructural de los nuevos prototipos antitumorales con activadores de AMPK podrían aventurar un mecanismo de acción similar.