dianas 12(1) > Bargiela-Cuevas etal

dianas | Vol 12 Num 1 | marzo 2023 | e202303av03

Inmunolocalización de HAT1 en tumores cerebrales.

Sandra Bargiela Cuevas, María Gabaldón Ojeda, Esther Palacios Gómez, Paula Granado Cano, Alfonso Esteban Lasso, Cristina Martínez Toledo, José Ignacio Klett Mingo, Ignacio García-Tuñón, Miguel Ángel Ortega Núñez

Inari Biotech, Dpto. Biomedicina UAH, Departamento de Medicina y Especialidades Médicas UAH.

a. inaribiotech@gmail.com

VIII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
21 a 24 de marzo, 2023. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Resumen

HAT1 es una histona acetil transferasa de tipo B cuya función mejor conocida es la de acetilar la histona H4 en el citosol, antes de su translocación al núcleo. En los últimos años se han descrito más de 100 sustratos de HAT1 y se ha planteado su implicación en múltiples funciones celulares y diversas patologías. En la mayoría de los tumores estudiados se produce una sobreexpresión de HAT1 con respecto al tejido no tumoral. Este aumento de sus niveles se ha relacionado con la progresión de la enfermedad, el desarrollo de resistencia al tratamiento y una menor supervivencia. Existen pocos datos sobre la expresión de HAT1 en tumores cerebrales. El objetivo de este estudio era analizar los patrones de inmunolocalización del enzima en gliomas, oligodendrogliomas y meningiomas, comparando los de menor grado con los de mayor grado. Se usaron muestras de 79 pacientes incluidas en parafina, las secciones se sometieron a procedimientos de recuperación antigénica con olla exprés y se incubaron con el anticuerpo policlonal anti-HAT1 (GeneTex). Para detectar la señal se utilizó un sistema de amplificación basado en polímeros, con 3-3´-diaminobenzidina como cromógeno, y las muestras se tiñeron con hematoxilina de Caracci. En los meningiomas de bajo grado y las zonas de tejido no tumoral, la mayoría de las células eran inmunonegativas, aunque algunas células gliales y neuronas del córtex presentaban una señal débil y difusa en el citoplasma y el núcleo. En las zonas tumorales, tanto la intensidad de la señal como la proporción de células marcadas aumento significativamente, con un patrón de distribución fundamentalmente nuclear. Se observo un aumento de la señal estadísticamente significativo en los tumores cerebrales de alto grado (glioblastoma multiforme, astrocitoma de grado 3, oligodendroglioma de grado 3, y meningioma de grado 3), con respecto a los tumores cerebrales de bajo grado (meningioma y astrocitoma de grados 1 y 2, y oligodendroglioma de grado 2). Además del aumento de la señal nuclear, en los tumores de mayor grado se observó un aumento de la señal citosólica. En los gliomas se comprobó que los tumores de los pacientes con supervivencia menor de 24 meses mostraban una expresión de HAT1 significativamente mayor que los pacientes con supervivencia mayor de 24 meses. En conclusión, se demostró que el aumento de la expresión de HAT1 se relaciona con tumores más agresivos y de peor pronóstico. Inari agradece a la CAM la concesión de ayudas del programa Investigo.

dianas 12(1) > Granado-Cano etal

dianas | Vol 12 Num 1 | marzo 2023 | e202303av02

Expresión de HAT1 y EZH2 en cáncer de próstata.

Paula Granado Cano, Esther Palacios Gómez, Alfonso Esteban Lasso, Sandra Bargiela Cuevas, María Gabaldón Ojeda, Cristina Martínez Toledo, Ignacio García-Tuñón, Miguel Ángel. Ortega Núñez

Inari Biotech, Dpto. Biomedicina UAH, Dpto. Medicina y Especialidades Médicas UAH.

a. inaribiotech@gmail.com

VIII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
21 a 24 de marzo, 2023. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: HAT1; EZH2; ARV7; cáncer de próstata

Resumen

En el transcurso del tratamiento con pautas antiandrogénicas, hasta un 30% de los pacientes con cáncer de próstata dejan de responder a la terapia y desarrollan tumores especialmente agresivos. En las últimas décadas ha cobrado peso la idea de que los cambios en la respuesta al bloqueo hormonal están mediados por alteraciones epigenéticas. El aumento de la expresión de la histona acetil-transferasa HAT1, se ha implicado recientemente en la progresión del cáncer de próstata y el desarrollo de enfermedad resistente a la castración. En cáncer de páncreas, se ha demostrado que HAT1 promueve la resistencia a la terapia regulando EZH2, metil-transferasa que también se ha relacionado con el desarrollo y progresión del cáncer prostático. En este estudio hemos analizado los patrones de inmunolocalización de HAT1 y EZH2 en muestras de pacientes (10 hiperplasias benignas y 80 neoplasias malignas), correlacionándolo con la expresión de receptor de andrógenos (RA), la variante 7 del receptor de andrógenos (ARV7) y la progresión de la enfermedad. En la muestras de hiperplasia benigna se observó moderada señal para RA y ausencia de señal para HAT1, EZH2 y ARV7. En todas las muestras tumorales se observó señal para HAT1, un 70.7% fueron positivas para EZH2, un 97.46% para AR y un 38.15% para ARV7. Los centros germinativos de los nódulos linfoides mostraron intensa señal para HAT1 y EZH2 y se consideraron controles internos positivos en base a los datos publicados. Los tumores hormono sensibles mostraban moderada señal para HAT1 y AR, y escasa o nula señal para EZH2 y ARV7. Sin embargo, las muestras de tumores hormono resistentes mostraban en el 80% de los casos intensa señal para HAT1, EZH2 y AR, y moderada señal para ARV7. En conclusión, observamos una correlación positiva en el inmunomarcaje para HAT1 y EZH2, que se relacionan además con la expresión de ARV7. La expresión de estos marcadores se correlacionó con progresión de la enfermedad y la menor supervivencia de los pacientes. Finalmente se analizó la expresión de estos marcadores en cultivos celulares (22RV1, PC3, DU145 y LNCaP pases 8, 70 y 170) mediante western blot. Se observo que los niveles de HAT1 y EZH2 son mayores en líneas celulares de conocida resistencia al bloqueo androgénico. Planteamos la posibilidad de que la expresión de HAT1 y EZH2 pueda tener valor pronostico en cáncer de próstata. Inari agradece a la CAM la concesión de ayudas del programa Investigo.

dianas 12(1) > Bargiela-Cuevas etal

dianas | Vol 12 Num 1 | marzo 2023 | e202303av01

Estudio comparativo de los métodos de aptahistoquímica e inmunohistoquímica para la detección de HAT1.

Sandra Bargiela Cuevas, María Gabaldón Ojeda, Esther Palacios Gómez, Paula Granado Cano, Alfonso Esteban Lasso, Cristina Martínez Toledo, José Ignacio Klett Mingo, Miguel Ángel Ortega Núñez, Ignacio García-Tuñón

Inari Biotech, Dpto. Biomedicina UAH, Dpto. Medicina y Especialidades Médicas UAH.

a. inaribiotech@gmail.com

VIII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
21 a 24 de marzo, 2023. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: HAT1; aptahistoquímica; aptámero; inmunohistoquímica

Resumen

Los aptámeros son secuencias de RNA o DNA de cadena sencilla que reconocen a una molécula diana de forma específica y con alta afinidad. Se han comparado con los anticuerpos y se han utilizado como sustitutos de estos en los métodos de inmunodetección (aptahistoquímica). Todavía son escasos los estudios empleando aptahistoquímica y todos ellos destacan sus ventajas en términos de sensibilidad y especificidad. El objetivo de este trabajo fue comparar los métodos de inmunohistoquímica y aptahistoquímica para la detección de histona acetiltransferasa 1 (HAT1). Se empleó un anticuerpo policlonal anti-HAT1 (GeneTex) y dos aptámeros anti-HAT1 (AptHAT610 y AptHAT63T) conjugados con digoxigenina (facilitados por el grupo de aptámeros del Hospital Ramon y Cajal). Se analizaron muestras de pacientes con glioblastomas, oligodendrogliomas y tejido cerebral no tumoral procedente de necropsias e incluidos en parafina. La localización de la señal en los distintos tejidos estudiados fue similar, aunque los aptámeros proporcionaron una mayor intensidad de marcaje que los anticuerpos. Para ambos métodos fue necesaria la recuperación antigénica mediante calor y presión (tratamiento en olla exprés). Además, comprobamos que, a diferencia del anticuerpo empleado, tiempos de incubación de 2h proporcionaban una señal similar a la obtenida tras 18h a las mismas concentraciones, lo que facilita el poder realizar la aptahistoquímica en un solo día. Para la detección del aptámero se empleó un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con peroxidasa, revelado con DAB. Sin embargo, para la detección de la señal empleando el anticuerpo fue necesario un sistema de amplificación de señal basado en polímeros, lo que apunta a una mayor sensibilidad de los aptámeros. En todos los casos, la relación señal/ruido fue superior con el empleo de aptámeros. Aumentando la concentración de los aptámeros se observó la saturación de la señal sin ruido de fondo, mientras que incrementando la concentración del anticuerpo también aumentaba la señal inespecífica. En conclusión, la aptahistoquímica para la detección HAT1 es sensible y específica, en general no requiere puentes de amplificación lo que acorta el proceso y abarata costes y se puede realizar en un solo día. HAT1 se ha implicado en patologías como el cáncer, infecciones virales y enfermedades inflamatorias y se ha propuesto como un nuevo biomarcador. En este contexto, los métodos de aptahistoquímica desarrollados suponen una alternativa más sensible y específica a la inmunolocalización de HAT1. Inari agradece a la CAM la concesión de ayudas del programa Investigo.

dianas 12(1) > García-García etal

dianas | Vol 12 Num 1 | marzo 2023 | e202303ap02

Blistering and inflammation in the skin of transgenic mice expressing human IKKα only in the nucleus of keratinocytes.

Verónica A. García-García, Ana M. García-Hernando, Josefa P. Alameda, Adrián Tejero, Raúl Mateo-Gallego, Angustias Page, Rosa A. García, M. Llanos Casanova

CIEMAT.

a. veronicaa.garciagarcia@ciemat.es; veronicaarantxagg@gmail.com

VIII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
21 a 24 de marzo, 2023. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Keywords: IKKα; skin; epidermal blistering; inflammation

Abstract

IKKα is part of the cytoplasmic kinase IκB complex (IKK) necessary for the activation of the NF-κB transcription factor in the canonical and alternative pathways, which regulates a large number of genes involved in different processes of the immune and inflammatory response, cell proliferation and apoptosis. IKKα exerts a wide variety of functions that depends on its nuclear or citoplasmatic localization in cells being one of them the control of the terminal differentiation of the epidermis that exerts in the nucleus of keratinocytes independently of its kinase activity. According to this function, it is likely that disturbances in the levels of expression or subcellular localization of IKKα leads to the development of skin diseases. However, this is an underexplored subject. Recently, we have analyzed transgenic mice expressing human IKKα under the control of the keratin 5 (K5) promoter in the nucleus of keratinocytes both in the presence and absence of endogenous IKKα (K5-N-hIKKα and mIKKα-/-/N-hIKKa mice, respectively). The histopathological examination of our two mouse models showed regions of epidermal atrophy and an exacerbated epidermal differentiation; in addition, other changes detected in the skin of IKKα include the appearance of areas of inflammation and sporadic foci of dermoepidermal separation or intraepidermal rupture. Immunohistochemical analysis showed defects on the expression of Desmoglein 3, K5 and collagen XVII in the skin of transgenic mice, as well as foci of CD45 positive staining indicating the presence of inflammatory cells. Thus, our data suggest that the dysregulation of IKKα signaling could be involved in the appearance of inflammatory blistered cutaneous diseases.

dianas 12(1) > Mateo-Gallego etal

dianas | Vol 12 Num 1 | marzo 2023 | e202303ap01

Análisis de expresión génica de adenocarcinomas de pulmón.

Raúl Mateo-Gallego, Ramón García-Escudero, Manuel Navarro, M Jesús Fernández-Aceñero, Adrián Tejero, Angustias Page, Verónica A García-García, Rosa A García-Fernández, Federico Sánchez-Sierra, M Pilar Hernández, Josefa P Alameda, M Llanos Casanova

CIEMAT. Avenida Complutense, 40. Madrid 28040.

a. raul.mateo@externos.ciemat.es; raul.mateo3b@gmail.com

VIII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
21 a 24 de marzo, 2023. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: IKKalpha; Adenocarcinoma; EMT; Transcriptómica

Resumen

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con tumores, siendo los adenocarcinomas (ADC) el tipo de cáncer de pulmón más frecuente. Sin embargo, no se han logrado tratamientos curativos ni una prolongación sustancial de la supervivencia del paciente debido a su diseminación metastásica y a la resistencia a los tratamientos. En trabajos previos del grupo describimos que la proteína IKKα, principalmente conocida por su función en la activación de NF-kB, favorece la progresión de los ADC cuando se localiza tanto en el núcleo como en el citoplasma de las células tumorales. En este trabajo hemos profundizado en los mecanismos moleculares por los que IKKα promueve la malignidad de los ADC. Como modelo de estudio hemos analizado tumores obtenidos en xenografts de las células de cáncer de pulmón H460, que sobreexpresan IKKα exógena en el núcleo o en el citoplasma (denominados células N- y C-H460-IKKKα, respectivamente). Nuestros análisis del datos del análisis de cambios en el perfil de expresión génica (RNA seq) entre los tumores H460 que expresan o no IKKα exógeno ha demostrado que IKKα induce la expresión de TFG-β1, conocido por ser un impulsor de la progresión tumoral y la metástasis. Además, en el caso de los tumores N-H460-IKKα, IKKα nuclear induce la expresión de genes reconocidos como promotores de la transición epitelio-mesénquima (EMT). En conjunto, nuestros datos muestran que los niveles elevados de IKKα en el núcleo o el citoplasma de las células de ADC inducen cambios protumorales y prometastásicos, sugiriendo que IKKα podría ser un objetivo terapéutico potencial para el tratamiento del ADC