dianas 11(1) > Coronel-López etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203d07

Papel de la Proteína Precursora Amiloide (APP) en la biología de células madre neurales humanas.

Raquel Coronel López^a, Victoria López Alonso, Eduardo Arilla Ferreiro, Isabel Liste Noya

Unidad de Regeneración Neural, UFIEC, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España.; Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. raquelicoronel@gmail.com

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Proteína Precursora Amiloide; APP; células madre neurales humanas; hNSCs

Resumen

La Proteína Precursora Amiloide (APP) es una glicoproteína transmembrana de tipo I que se expresa ampliamente en el sistema nervioso central. Numerosos estudios se han centrado en el papel fisiopatológico de la APP en la Enfermedad de Alzheimer (EA), e incluso en Síndrome de Down (SD), pero su función fisiológica todavía es poco conocida. Específicamente, la APP parece jugar un papel clave en la proliferación, diferenciación y maduración de células madre neurales (NSC).

En el laboratorio, hemos examinado la expresión endógena de APP en células hNS1, una línea celular modelo de NSC humanas, tanto en proliferación como durante el período de diferenciación celular. Nuestros resultados muestran una elevada inmunorreactividad frente a la APP en células hNS1, lo que nos indica que esta proteína podría estar jugando un papel clave e importante. Para profundizar en la función biológica de la APP en NSC humanas, realizamos estudios tanto de ganancia de función (mediante plásmidos que contienen la secuencia codificante para la isoforma APP695) como estudios de pérdida de función (mediante siRNA frente APP) en células hNS1 y analizamos sus efectos en proliferación, diferenciación y especificación fenotípica.

El conocimiento de las funciones biológicas y fisiológicas de la APP, así como las posibles vías de señalización que podrían estar implicadas, son fundamentales para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la EA.

dianas 11(1) > Soto etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203d06

MiR-182-5p and miR-138-5p regulate Nogo A/ Nogo receptor expression, promoting neurite outgrowth in neural cells.

Altea Soto, Manuel Nieto-Diaz, María Asunción Barreda-Manso, Teresa Muñoz-Galdeano, David Reigada, Rodrigo M. Maza

Grupo Neuroprotección Molecular - Hospital Nacional de Parapléjicos. Finca la Peraleda s/n, 45071, Toledo, España.

a. alteasotoneira@gmail.com

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Keywords: microARNs; neurite outgrowth; axonal regeneration; Nogo-A; NgR1

Abstract

Durante el desarrollo posnatal, las neuronas del sistema nervioso central (SNC) pierden su capacidad de regeneración en parte debido a la presencia de inhibidores del crecimiento axonal asociados a mielina como son Nogo-A, OMgp o MAG. Concretamente, Nogo-A se expresa en la superficie de los oligodendrocitos produciendo la inhibición del crecimiento neurítico/axonal mediante la unión a su receptor, NgR1, ubicado en las neuronas del SNC. La implicación de Nogo-A en neurodegeneración ya ha sido descrito en diversas enfermedades neurodegenerativas como esclerosis múltiple, Alzheimer o esclerosis lateral amiotrófica, así como en lesiones traumáticas del SNC como lesión medular (LME) y cerebral. Tras un daño al SNC, se producen cambios en la expresión de numerosos genes que juegan papeles importantes en procesos de regeneración axonal, como Nogo-A y NgR1, los cuales a su vez pueden estar regulados por diferentes microARNs. Los microARNs son reguladores postranscripcionales implicados en procesos de diferenciación neuronal, sinaptogénesis, plasticidad o crecimiento neurítico, entre otros. Por ejemplo, miR-133b, miR-135a-5p y miR-29a regulan el crecimiento neurítico y la regeneración axonal a través de la regulación de RhoA, ROCK1/2 y PTEN, respectivamente.

En este trabajo, se describe y valida por primera vez la regulación postranscripcional que producen miR-182 y miR-138 sobre Nogo-A y NgR1, respectivamente, la cual disminuye la expresión de ambas proteínas, promoviendo el crecimiento neurítico de células neurales in vitro. Concretamente, el co-cultivo de células C6 transfectadas con miR-182, con neuronas primarias del hipocampo de rata aumentó el crecimiento neurítico de estas últimas. Además, la disminución de la expresión de NgR1 por miR-138 en células PC12 también aumentó la longitud de las neuritas. Estos resultados sugieren a ambos microARNs como una prometedora herramienta terapéutica para tratar enfermedades o condiciones que implican patología axonal como las descritas anteriormente.

dianas 11(1) > Martinez-Toledo etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203d05

In vitro cell migration quantification application using Labview for scratch assays.

Cristina Martinez Toledo, Jose Ignacio Klett Mingo, Sergio Perosanz Amarillo

Universidad Politécnica de Madrid. Inari Biotech.

a. inaribiotech@gmail.com

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Keywords: scratch assay; Labview; image analysis; cell migration

Abstract

In vitro assays are essential for the study of cell migration since they allow to quantify cell migratory capacity under controlled experimental conditions. The scratch or wound healing assay is the method of choice for studying cell migration due to the low cost and simplicity of its experimental design. The scratch assay is the technique used to assess the contribution of molecular and cellular mechanisms to cell migration including cell signaling studies. The assay can also be used to evaluate therapeutic compounds before clinical use. Current quantification methods of scratch assays deal poorly with irregular cell-free areas and crooked leading edges which are features typically present in the experimental images. Obtaining statistically significant results on cell migration requires time-consuming analysis of hundreds of images. Different software tools increasing quantitative output through automated image segmentation have been developed, but up to date, none of them becomes widely used for high-throughput study of wound healing due to the necessity to adjust parameters manually. In the current study, we developed a software application based on labview for automated image segmentation with a minimal set of adjustable parameters. It was tested for the accuracy and reproducibility and then used to analyze hundreds of images from scratch assays. In summary, we have introduced a new method for migration quantification of typical scratch assay data.

dianas 11(1) > Martos-Esteban y Perosanz-Amarillo

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203d04

Optimización de métodos de ensayo en biología mediante Deep Learning.

Irene Martos Esteban, Sergio Perosanz Amarillo

Universidad Politécnica de Madrid. Inari Biotech S.L.

a. inaribiotech@gmail.com

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Análisis de Imagen; Deep Learning: Labview; Microaspiración

Resumen

Los grandes avances de la biotecnología están poniendo a prueba los sistemas de testeo y de análisis de imagen. Los nuevos campos de estudio requieren softwares que puedan adaptarse a sus necesidades para proporcionar resultados lo más claros y eficientes posibles.
El campo de investigación que cubre este proyecto son los denominados ensayos de aspiración con micropipeta. En estos ensayos se hace pasar de forma total o parcial una célula de un medio al interior de la micropipeta a partir de una diferencia de presión. De esta forma se ha creado un software mediante el entorno de programación LabView para analizar las imágenes obtenidas de tales ensayos. Otras plataformas ya existentes en el mercado usadas para el análisis de imagen no ofrecen las herramientas necesarias para estos tipos de ensayos, ya que no se puede usar un método genérico de análisis al tratarse de células con diversas morfologías.
Este programa se ha creado con el objetivo de buscar una solución eficiente para la medición de parámetros mecánicos como la elasticidad o la tenacidad de las membranas celulares. A partir de estos parámetros se puede conocer de forma exacta el comportamiento mecánico de diversos sistemas biológicos a partir de las imágenes tomadas en los ensayos de microaspiración.
El proceso de análisis de estas imágenes consta de una primera fase de focalización sobre la región de interés. A continuación, mediante un modelo de segmentación de imagen basado en Deep Learning, en concreto de las redes tipo U-NET, el programa es capaz de reconocer la ubicación de la célula en proceso de microaspiración dentro de la imagen. El software creado es capaz de seguir a la célula a través de los fotogramas obtenidos en el ensayo para crear un patrón de movimiento y por lo tanto medir las variaciones su morfología a lo largo del ensayo. El impacto de este software reside en que es fácilmente implementable en ensayos en vivo. De esta forma los resultados de estos análisis de imagen o video se realizarán de forma inmediata mejorando así los tiempos de cada investigación.

dianas 11(1) > Alcón-Calderón etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203d03

Desarrollo de un nuevo método para la evaluación in vitro de la actividad tripanotión sintetasa de Leishmania infantum.

María Mercedes Alcón-Calderón, Juan Carlos García-Soriano, Héctor De Lucio-Ortega, Federico Gago-Badenas, Antonio Jiménez-Ruiz

Universidad de Alcalá.

a. mercedes.alcon@edu.uah.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Tripanotión sintetasa; tripanotión; estrés oxidativo; ensayo enzimático; inhibidores.

Resumen

La leishmaniasis es considerada como una de las principales enfermedades tropicales desatendidas (ETD) que provoca más de 30.000 muertes anuales según la Organización Mundial de la Salud (OMS). Hasta la fecha, no hay vacunas autorizadas frente a esta enfermedad y los escasos medicamentos aprobados carecen de eficacia y se caracterizan por una elevada toxicidad y alto coste. Este hecho determina la necesidad de desarrollar novedosas estrategias que permitan el diseño de nuevos fármacos. Esta enfermedad, que se transmite por la picadura de flebótomos, es causada por un parásito protozoo del género Leishmania. Tras la inoculación, el sistema inmune del hospedador reacciona mediante la activación de macrófagos y genera una explosión oxidativa con el objetivo de frenar la infección. No obstante, el parásito es capaz de combatir el estrés oxidativo y asegurar su supervivencia mediante un sistema basado en un ditiol de bajo peso molecular, el tripanotión. Este compuesto está presente exclusivamente en tripanosomátidos y no en células de mamífero, representando el principal mecanismo de defensa de los parásitos contra el daño oxidativo. Además, este mecanismo difiere de otros presentes en eucariotas, por lo que constituye un objetivo específico para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. La síntesis del tripanotión se realiza por la tripanotión sintetasa (TryS) que es, por tanto, una enzima esencial para la supervivencia del parásito y que ha sido validada como diana para el desarrollo de fármacos. Nuestros esfuerzos se centran en implementar un nuevo método para la determinación de la actividad de la enzima TryS como procedimiento para el cribado de posibles inhibidores que conduzcan a la desestabilización del equilibrio redox del parásito y, consecuentemente, a su muerte.

dianas 11(1) > Tapias-Martín etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203d02

La actividad de la carnitina palmitoil transferasa I es esencial para la motilidad del espermatozoide de cerdo.

Marina Tapias-Martín, José Miguel Godoy, Rebeca Serrano, Luis García-Marín, María Julia Bragado, David Martín-Hidalgo

Universidad de Extremadura.

a. mtapiasm@alumnos.unex.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: motilidad; espermatozoide; cerdo; carnitina palmitoil transferasa I (CPT-I); Etomoxir; ácidos grasos

Resumen

El espermatozoide es el gameto masculino cuya función biológica es la fecundación del óvulo y para llevarla a cabo requiere energía. Hasta hace unos años, la literatura científica se había centrado en los glúcidos como la principal fuente energética del espermatozoide. Pero los últimos estudios están cambiando el paradigma metabólico del espermatozoide, indicando un posible papel de los ácidos grasos (AG). El objetivo de este trabajo es determinar si la entrada de AG en la mitocondria y, por tanto, su posterior catabolismo, son necesarios para procesos funcionales esenciales del espermatozoide de cerdo, como la motilidad y viabilidad. Nuestra aproximación experimental se basa en estudiar la inhibición de la actividad de la carnitina palmitoil transferasa I (CPT-I), enzima responsable del transporte de AG al interior mitocondrial en el espermatozoide de cerdo. Para ello, se incubaron los espermatozoides con varias concentraciones (10, 30, 100 y 300 μM) del inhibidor específico de la CPT-I, Etomoxir (Eto), durante diferentes tiempos, estableciéndose Eto 300 μM y 1 h como condiciones experimentales óptimas. Tras el tratamiento con Eto, se analizaron la motilidad espermática, mediante el sistema C.A.S.A y el software ISAS® y la viabilidad espermática, el potencial de membrana mitocondrial (PMM) y el estrés oxidativo (cell-ROX y MitoSOX) por citometría de flujo. Para descartar un efecto inespecífico del Eto en el complejo I mitocondrial, se incubaron también con un inhibidor específico de dicho complejo, Rotenona (Rot). La incubación de los espermatozoides de cerdo con Eto 300 μM durante 1 h provoca una reducción en la motilidad espermática, destacando un descenso del 83 % en la población de espermatozoides rápidos progresivos, además de en las diferentes velocidades espermáticas: curvilínea (52 %), rectilínea (65 %) y velocidad promedio (61 %). Sin embargo, la viabilidad espermática, el PMM o el estrés oxidativo no se ven afectados por el tratamiento con Eto. El tratamiento con Rot (10 μM), sí altera estos dos últimos parámetros. En conclusión, este trabajo sugiere que la motilidad de los espermatozoides de cerdo es, al menos parcialmente, dependiente del metabolismo mitocondrial de ácidos grasos. Por otro lado, la inhibición de la CPT-I en el espermatozoide no compromete su viabilidad, ni parece estar mediada por efectos en el complejo I mitocondrial, el PPM o mediante la generación de estrés oxidativo Este trabajo abre una línea de investigación para determinar los sustratos energéticos y las vías metabólicas que permiten al espermatozoide desempeñar su función esencial, la fecundación.

dianas 11(1) > Mínguez-Martínez

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203d01

Papel de los receptores RXRs en macrófagos alveolares.

Jorge Mínguez-Martínez

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), C/ Melchor Fernández Almagro, 3, 28029 Madrid.

jorge.minguez@cnic.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Resumen

Los macrófagos residentes de tejido son células del sistema inmune que desempeñan funciones de defensa y ejercen un papel fundamental y específico del tejido en que residen. El origen de estas células varía en función del tejido, pudiendo tener un origen embrionario o ser progresivamente sustituidos por macrófagos derivados de la médula ósea. Los macrófagos alveolares son macrófagos residentes de origen embrionario localizados en el interior de los alveolos, constituyendo la primera línea de defensa contra los patógenos que entran en el cuerpo a través de las vías respiratorias. Asimismo, son los encargados de mantener los niveles de lípidos y proteínas surfactantes en los niveles adecuados para evitar el colapso del alveolo y, de una forma más general, mantener la homeostasis del pulmón. Los receptores X retinoides (RXRs) son factores de transcripción dependientes de ligando altamente expresados en los macrófagos de origen embrionario durante el desarrollo y en homeostasis. Los RXRs forman homodímeros y heterodímeros con muchos otros miembros de la superfamilia de los receptores nucleares y desempeñan funciones muy importantes en desarrollo, proliferación, muerte celular, metabolismo y diferenciación. Teniendo en cuenta que la identidad de los macrófagos residentes viene determinada por las señales que reciben del nicho, los RXRs se plantean como un eje central de la señalización de receptores nucleares en los macrófagos alveolares que inducen la expresión de sets de genes característicos. De igual forma, dado el papel fundamentalmente antiinflamatorio de los RXRs, tanto la caracterización de los mismos en los macrófagos alveolares como el uso de ligandos activadores de estos receptores supone un frente abierto para el descubrimiento de nuevos fármacos. En esta comunicación, se presentan los resultados del estudio del papel de los RXRs en la identidad de los macrófagos alveolares utilizando modelos específicos de ratón.