dianas 5(1) > Sosa-Callejas etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160352

Papel de la hiperfosfatemia en la sarcopenia: Homeostasis proteica y senescencia.

Patricia Sosa Callejas^1, a, Nuria Troyano¹, Inés Mora², Diana Medrano³, Patricia Plaza¹, Mercedes Griera¹, Marco Hatem¹, Gemma Olmos¹, Susana López³, María Piedad Ruiz-Torres¹

1. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud. Universidad de Alcalá and Unidad de investigación.  2. RedinRen, Instituto de Salud Carlos III. Madrid. Spain.  3. Fundación para la Investigación Biomédica, Hospital Príncipe de Asturias. Alcalá de Henares.

a. patricia.sosacalle@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: Sarcopenia; senescencia; hiperfosfatemia; mioblasto; enfermedad renal crónica

Resumen

INTRODUCCIÓN. Se ha descrito un aumento en la concentración sérica de fosfato en la enfermedad renal crónica y en el envejecimiento. Una patología asociada en ambos casos es la sarcopenia, caracterizada por la pérdida de masa y fuerza muscular, que puede ser debida, en parte, a la pérdida de la capacidad regenerativa en el músculo. El objetivo del trabajo fue estudiar si la hiperfosfatemia induce la pérdida de la capacidad regenerativa muscular debido al aumento de la senescencia de los mioblastos y los mecanismos implicados en este fenómeno. MATERIALES Y MÉTODOS. Se utilizaron mioblastos C2C12 de ratón en cultivo. Las células fueron tratadas con 10 mM de β-glicerofosfato (BGP) durante 24, 48 o 72 horas como donador de fósforo extracelular. Se analizó la expresión de genes de senescencia como p16, p21 y p53 mediante western blot. El porcentaje de células senescentes identificado por la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia, fue analizado por microscopia confocal utilizando el substrato, 5-dodecanoylaminofluoresceina di-beta-D-galactopyranosido. Para demostrar una relación directa entre hiperfosfatemia y senescencia se utilizó ácido fosfonofórmico, inhibidor del transportador Na-Pi. Se estudió el efecto del BGP sobre los distintos sistemas de degradación proteica, midiendo la actividad del proteosoma, mediante el uso de un sustrato fluorogénico específico, y la autofagia, analizando los niveles de expresión de p62 y LC3I respecto a LC3II, mediante western blot. La actividad total de calpainas, mediante el uso de un sustrato fluorogénico específico y la expresión de calpainas 1, 2 y 3 analizada por western blot. Para establecer si el efecto sobre los sistemas de degradación proteica fue responsable de la senescencia inducida por BGP se midió está en presencia de 1uM calpeptina, inhibidor de calpainas, y 50nM de rapamicina, activador de la autofagia. RESULTADOS. BGP incrementó la expresión de p53, así como el porcentaje de células senescentes. El uso del ácido fosfonofórmico suprimió este incremento durante el tratamiento con BGP, lo que indica que la senescencia fue dependiente del aumento de BGP. Se observó que el BGP induce una disminución de la actividad del proteosoma y un aumento de p62 y LC3I/LC3II, lo que se corresponde con una disminución de la autofagia. Respecto a la actividad total y la expresión de calpainas 1, 2 y 3 el BGP induce un incremento en ambos valores. La adición de calpeptina inhibió el aumento en p53, lo que indica que la vía de las calpainas está relacionada con el efecto senescente del BGP. Cuando se procedió a la activación de la autofagia con rapamicina se comprobó que no se producían los aumentos de genes senescentes con BGP, indicando que la autofagia jugó un papel central en la inducción de la senescencia. CONCLUSIÓN. El aumento en la concentración de fósforo extracelular induce senescencia en los mioblastos de musculo esquelético, estas células muestran un incremento en la actividad de calpaina y una disminución de la actividad proteolítica del proteosoma y la autofagia. Esta alteración en la homeostasis de proteínas está implicada en la inducción de senescencia en los mioblastos y este podría ser un mecanismo involucrado en la progresión de la sarcopenia ligada a envejecimiento o enfermedad renal crónica.

1. N. Troyano et al. Hyperphosphatemia induces cellular senescence in human aorta smooth muscle cells through integrin linked kinase (ILK) up-regulation. Mechanisms of Ageing and Development, 2015


2. S. Burattini et al. C2C12 murine myoblast as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry, 2004.


3. Nasser Al-Shantia et al. Activated Lymphocytes Secretome Inhibits Differentiation and Induces Proliferation of C2C12 Myoblasts. Cell Physiol Biochem 2014; 33:117-128

dianas 5(1) > de-la-Usada-Molinero etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160351

NONADICTINA, un tratamiento teórico para la adicción.

Eduardo de la Usada Molinero, Fernando Fernández García, Laura Martín Díaz, Javier Merino Valverde, Lorena Torres Valle

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. edu231288@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: ΔFosB; adicción; cocaína; siRNA; liposomas

Resumen

España lidera el ranking mundial en consumo de cocaína según el Observatorio Europeo de las Drogas y las Toxicomanías. El consumo crónico de esta sustancia conlleva unos efectos que derivan en una adicción que impide al enfermo llevar una vida normal, pues se imponen unas pautas comportamentales a través de la vía de recompensa cerebral que le dirigen a la búsqueda compulsiva de la droga. Por esta razón es más importante encontrar un tratamiento que ayude al paciente a superar esta situación que uno que palíe los síntomas del síndrome de abstinencia. La cocaína bloquea la recaptación de dopamina a nivel de la sinapsis entre la neurona presináptica dopaminérgica del área tegmental ventral y la neurona postsináptica del núcleo accumbens, aumentando la estimulación por dopamina en éste último, el cual está relacionado con fenómenos de recompensa. La dopamina se une a sus receptores de tipo D1, produciendo la activación o la represión transcripcional de distintos genes, donde juega un papel primordial el factor transcripcional ΔFosB, y la activación de la vía de las MAPK [1]. A largo plazo, la acumulación patológica de ΔFosB conduce a una expansión de dendritas neuronales y a una disminución en la expresión de dinorfina, opioide endógeno implicado en la regulación negativa de la estimulación dopaminérgica. Distintos autores relacionan estos hechos con un aumento de los mecanismos de recompensa que conducen finalmente a la adicción [2]. En este trabajo proponemos un hipotético tratamiento para la adicción a la cocaína basado en el conocimiento de las vías de señalización que desencadenan su consumo crónico. De las posibles dianas terapéuticas implicadas en la adicción, consideramos potencialmente útiles: los receptores de tipo D1, para los cuales se haría un análogo de la droga; y ΔFosB, variante de splicing de FosB que se acumula debido a su elevada estabilidad. Decidimos actuar sobre ΔFosB porque su acumulación parece ser la responsable directa de la adicción. FosB solo se diferencia de ΔFosB en que éste carece de los 101 aminoácidos del extremo C-terminal [3]; por lo que en vez de orientar nuestra terapia contra la proteína, lo cual sería poco específico, la dirigimos contra el RNA mensajero que codifica para ΔFosB. Diseñamos un siRNA específico de ΔFosB aprovechando las características diferenciales de su secuencia. Para ejercer su efecto sería necesario que atravesara la barrera hematoencefálica, para lo cual proponemos el empleo de liposomas catiónicos pues ya han demostrado su eficacia previamente [4]. Para probar la eficacia del tratamiento planteamos estudios in vitro e in vivo. Cabría esperar una disminución de ΔFosB a niveles basales con el tiempo, ya que el siRNA inhibe la síntesis de nuevo ΔFosB pero no actúa sobre el ya formado. El tratamiento daría lugar a una neuroadaptación que ayudaría a acelerar la recuperación en la rehabilitación y sería eficaz frente a recaídas. Dado que ΔFosB solo se encuentra alterado en patologías, su inhibición no debería tener efectos adversos, aunque no debemos descartar posibles efectos inespecíficos debidos al propio siRNA o a la formulación. Sería interesante administrar una terapia combinada a los pacientes, suplementando el tratamiento de siRNA con otros fármacos como agonistas los receptores de tipo D1 de dopamina y/o antidepresivos [5]. Por último, cabe destacar que el tratamiento propuesto podría ser eficaz para otras adicciones, pues todas convergen en la vía de recompensa y tienen en común la acumulación de ΔFosB.

1. Ron D, Jurd R. 2005. The ‘ups and downs’ of signaling cascades in addiction. Sci STKE. 2005(309):re14


2. Nestler EJ. 2013. ΔFosB: a Molecular Switch for Reward. J Drug and Alcohol Research. 2(2013):art235651.


3. Ruffle JK. 2014. Molecular neurobiology of addiction: what’s all the (D)FosB about? Am J Drug Alcohol Abuse. 40(6):428-437


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5. Quednow BB, Herdener M. 2015. Human pharmacology for addiction medicine: From evidence to clinical recommendations. Prog Brain Res. 224:227-50

dianas 5(1) > Pérez-Hernández etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160343

Implicación de MMP-9 en los cambios de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la formación de edema inducidos por MDMA en la rata.

Mercedes Pérez-Hernández, Ana Rubio-Araiz, María Dolores Gutiérrez-López, Esther O’Shea Gaya, M Colado Megía

1. Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Madrid (España).  2. Trinity College Institute of Neuroscience, Dublin (Irlanda).

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: MDMA; barrera hematoencefálica; MMP-9; edema; SB-3CT; receptores P2X7

Resumen

La droga de abuso 3,4-metilenodioximentanfetamina (MDMA) es un psicoestimulante de uso social cuyo consumo va dirigido a la obtención de una sensación de euforia y apertura emocional. La administración periférica de MDMA en ratas produce, entre otras manifestaciones, una respuesta neuroinflamatoria caracterizada por la activación microglial. La integridad de la barrera hematoencefálica (BHE) es imprescindible para la homeostasia del sistema nervioso central (SNC) y puede ser alterada por los procesos inflamatorios. Las citoquinas proinflamatorias y las especies reactivas de oxígeno son capaces de activar metaloproteinasas (MMPs) implicadas en la degradación de componentes proteicos de la BHE. El incremento de la permeabilidad de la BHE producido de este modo puede desencadenar la entrada de agua desde la sangre y su acumulación en el tejido formando edema. El presente estudio revela la alteración de la BHE y la consecuente generación de edema en el hipocampo de la rata, tras la administración periférica de una única dosis de MDMA. Concretamente, produce una disminución en la expresión de la proteína de las uniones estrechas, claudina-5 y de la laminina de la matriz extracelular, además de la sobreactivación de MMP-9. El pretratamiento con SB-3CT, un inhibidor de la actividad MMP-9, previene tanto la disminución de claudina-5 como la generación de edema y la sobreexpresión de canales de agua AQP4 encargados de su resolución. Esto confirma la implicación directa de MMP-9 en la alteración de la BHE inducida por MDMA. La activación microglial mediada por receptores P2X7 es la responsable del incremento en la actividad de MMP-9, como indica su ausencia tras el pretratamiento con Brilliant Blue G, un antagonista de dichos receptores. Estos resultados, además de contribuir al esclarecimiento del mecanismo de acción de la MDMA, son relevantes debido al hecho de que la alteración de la BHE supone un factor de vulnerabilidad para el SNC.

dianas 5(1) > Abuin etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160342

A single neurotoxic dose of MDMA increases kynurenine pathway metabolism in plasma and hippocampus of rat.

Cristina Abuin, Rebeca Vidal, María Dolores Gutiérrez, Esther O’Shea, María Isabel Colado

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Spain.

a. camartinez@ucm.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Keywords: MDMA; kynurenine pathway; rat hippocampus; serotonin; HPLC

Abstract

Introduction: The kynurenine pathway is the main route of tryptophan metabolism and under physiological conditions, it is responsible for over 95% of tryptophan degradation in mammals. Tryptophan is converted into the first stable molecule of the pathway, kynurenine, through the action of the enzymes tryptophan 2,3-dioxygenase and indoleamine 2,3-dioxygenase. The pathway is divided into two branches, one of which forms kynurenic acid by means of kynurenine aminotransferases, and the other of which, by the action of kynurenine mono-oxygenase, gives rise to 3-hydroxykynurenine, a precursor of the neurotoxin quinolinic acid. Kynurenine, kynurenic acid and quinolinic acid have been implicated in various neurological and neurodegenerative disorders [1]. 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA, ‘ecstasy’) is an amphetamine derivative that produces serotonergic neurotoxicity [2] and neuroinflammation manifested as increased production of interleukin-1β and microglial activation [3]. Objective: The aim of this study was to evaluate possible changes in the levels of major kynurenine pathway metabolites following MDMA administration. Materials and methods: Male Dark Agouti rats received a single neurotoxic dose of MDMA (12.5 mg/kg, i.p.) and were sacrificed 1 h, 3 h, 6 h, 24 h or 7 days later. Plasma and hippocampal concentrations of serotonin, tryptophan, kynurenine and kynurenic acid were measured by high pressure liquid chromatography. The ratios of serotonin/tryptophan and kynurenine/tryptophan were also calculated as an index of the activity of the enzymes involved in the metabolism of tryptophan. Results: MDMA increases hippocampal concentrations of tryptophan 1 h and 3 h after administration, returning to control concentrations at 6 h. No differences in plasma concentrations of tryptophan occur at any of the times measured compared with the control group. Kynurenine concentrations are also raised in hippocampus 1 h, 3 h and 6 h after MDMA as are the plasma concentrations 3 h and 6 h after drug administration. Furthermore, in hippocampus the kynurenine/tryptophan ratio is increased only 6 h after MDMA whereas in plasma, an increase is observed after 1 h, 3 h and 6 h. MDMA raises kynurenic acid concentrations at 6 h in hippocampus and at 3 h in plasma. Serotonin concentrations decrease in hippocampus at all the time-points evaluated, and in plasma at 3 h and 6 h. The serotonin/tryptophan ratio also decreases in hippocampus at all the times measured but only at 3 h and 6 h in plasma. Conclusions: Administration of a neurotoxic dose of MDMA in Dark Agouti rats leads to an imbalance of the kynurenine pathway, resulting in an increase in the kynurenine/tryptophan ratio in plasma and hippocampus reflecting an increase in IDO activity.

1. Chen Y, and Guillemin GJ (2009). Kynurenine pathway metabolites in humans: disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research 2: 1-19.


2. O'Hearn E, Battaglia G, De Souza EB, Kuhar MJ, and Molliver ME (1988). Methylenedioxyamphetamine (MDA) and methylenedioxymethamphetamine (MDMA) cause selective ablation of serotonergic axon terminals in forebrain: immunocytochemical evidence for neurotoxicity.The Journal of Neuroscience 8: 2788-03.


3. Torres E, Gutierrez-López MD, Borcel E, Peraile I, Mayado A, O’Shea E and Colado MI (2010). Evidence that MDMA (‘ecstasy’) increases cannabinoid CB2 receptor expression in microglial cells: role in the neuroinflammatory response in rat brain. Journal of Neurochemistry. 113: 67-78.

dianas 5(1) > Valenzuela-Tallón etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160341

Efectos de la activación de mTor o PGC1α mediante electroestimulación en variables estructurales y funcionales del músculo esquelético.

Pedro L Valenzuela Tallón, Andresa E de Melo, Joan Ramón Torrella, Pedro de la Villa

Unidad de Fisiología. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá. Departamento de Fisiología e Inmunología. Facultad de Biología, Universidad de Barcelona.

a. pedro.valenzuela92@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: masa muscular; electroestimulación; fuerza; hipertrofia

Resumen

Mantener unos niveles adecuados de masa muscular es esencial para la salud debido a sus variadas funciones, las cuales incluyen locomoción y metabolismo. En el proceso de contracción el músculo esquelético actúa como un órgano endocrino liberando al torrente sanguíneo una serie de moléculas denominadas mioquinas. Entre otros efectos, las mioquinas reducen el crecimiento tumoral y protegen de patologías crónicas como las cardiovasculares y las metabólicas [1]. Además, los niveles de masa muscular condicionan el gasto metabólico basal, así como el metabolismo de carbohidratos y la sensibilidad a la insulina, ejerciendo así una gran influencia en la prevención de la obesidad o la diabetes [2]. Por lo tanto, son necesarias herramientas que mejoren las condiciones del sistema músculo-esquelético o enlentezcan el proceso de atrofia. Distintos tipos de ejercicio físico provocan la activación de diferentes vías de señalización. Así, se ha demostrado que mientras que el ejercicio de resistencia aeróbica produce una activación de PGC1α a través de la activación de AMPK o CaMK -aumentando la biogénesis mitocondrial y la capilarización- el estrés mecánico y metabólico producido con el entrenamiento de fuerza produce una activación de la vía Akt/mTor que estimula la síntesis proteica pudiendo producir hipertrofia muscular [3]. La electroestimulación muscular (EMS) está siendo recientemente muy estudiada por su posible papel “simulador” de ejercicio, habiéndose observado que la EMS de baja frecuencia produce una activación de vías similares a las activadas con el ejercicio de resistencia aeróbica (PGC1α) mientras que la EMS de alta frecuencia produce una activación de señales hipertróficas (mTor/p60s6k) [4,5]. Para comprobar los efectos de la aplicación de EMS de alta frecuencia en el músculo esquelético hemos evaluado las propiedades estructurales y contráctiles del músculo Tibialis Anterior (TA) en 10 ratones C57BL/6J sometidos a 8 sesiones de EMS. Nuestros resultados muestran que la EMS de alta frecuencia produce un aumento significativo de la masa muscular (12,9%) y del área de sección transversal de las fibras musculares (15,6%). Además, aumenta también la máxima fuerza tetánica (17%) y el ratio de desarrollo de fuerza (21,6%). Estos resultados podrían ser la consecuencia de un aumento de la síntesis proteica por la activación de la vía de señalización Akt/mTor/p60s6k, lo cual provocaría hipertrofia y una mejora de las propiedades contráctiles de las fibras musculares. Por ello, concluimos que la electroestimulación muscular debe ser tenida en cuenta como herramienta para mejorar las condiciones musculares en cualquier población, pero en especial en aquellas personas en riesgo de atrofia y con dificultad para realizar ejercicio intenso como en situaciones de inmovilización o durante el envejecimiento.

1. Pedersen, BK (2011) Exercise-induced myokines and their role in chronic diseases. Brain, Behaviour and Immunity 25(5):811-816.


2. Fiuza-Luces C, Garatachea N, Berger N a, Lucia A (2013) Exercise is the real polypill. Physiology 28(5):330–358


3. Egan B, Zierath JR (2013) Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism 17(2):162–184.


4. Atherton PJ, Babraj J, Smith K, et al. 2005. Selective activation of AMPK-PGC-1α or PKB-TSC2- mTOR signaling can explain specific adaptive responses to endurance or resistance training-like electrical muscle stimulation. The FASEB Journal. 19(7):786–788.


5. Tsutaki A, Ogasawara R, Kobayashi K, et al (2013) Effect of Intermittent Low-Frequency Electrical Stimulation on the Rat Gastrocnemius Muscle. Biomed Research International. 2013 (1):1–9.

dianas 5(1) > Suárez-Cabrera etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160334

ERas (ES-cell expressed Ras) induces EMT and stem cell features in normal and tumorigenic human breast cells.

Cristián Suárez Cabrera, Bárbara de la Peña, Laura López-González, Josefa P. Alameda, M Llanos Casanova, María Angustias Page, Ángel Ramírez, Manuel Navarro

1. Molecular Oncology Unit, CIEMAT, Madrid, Spain. Avenida Complutense 40, 28040.  2. Oncogenomic Unit, Institute of Biomedical Investigation, Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain.

a. cristian.suarez@ciemat.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: ERas; breast; cancer; EMT; stem-cell

Resumen

Breast cancer is the most common cancer in women worldwide and it is the most frequent cause of cancer death in women [1]. This pathology is mainly classified based on hormone receptors and HER2 expression. Moreover, many genes (such as BRCA1, BRCA2 or TP53) are known drivers in mammary gland tumors. Despite these facts, the mechanisms of malignant progression and metastasis are not fully understood [2]. An important mechanism by which epithelial cells lose their cell polarity and cell-cell adhesion, and gain migratory and invasive properties is the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process [3]. Ras family proteins are frequently mutated in human cancer but, interestingly, these mutations are rare in breast cancer [4]. Recently it has been reported that others member of this superfamily (such as R-Ras2) could be implicated in breast cancer. ERAS is a member of the small GTPase RAS protein family and it is constitutively active without mutation. However, this gene is expressed only in embryonic cells, but not in somatic cells [6]. Previously, ERAS has been shown to be involved in gastric cancer, neuroblastoma and melanoma [7-9]. We hypothesize that ERAS could be reactivated in breast cancer and promote malignant transformation and metastasis of breast cells. In order to understand the role of ERAS in mammary cells, we forced its expression in normal human mammary gland cells (MCF10A) and in a tumorigenic breast cell line (MDA-MB-231). We observed that MCF10A-ERAS presented morphological changes, being more fusiform, and loss of cell-substrate adhesion. ERAS was localized mainly in plasmatic membrane, although it is also found in cytoplasm and in other organelles. ERAs-expressing cells had higher proliferation rate and motility than control MCF10A cells and, furthermore, induced EMT resulting in increased levels of transcription factors involved in this process, loss of E-Cadherin and gain of N-Cadherin. Besides, the miRNA-200 family members (especially cluster II) and miRNA-205, which are relevant in EMT process, were downregulated. Moreover, cells expressing this gene lost EpCam expression, acquiring a mesenchymal phenotype, and underwent a large increase in CD44^high/CD24^low/- population. In mammary gland, this subpopulation corresponds to stem cells, supporting that ERAS awards stem-like features. On the other hand, expression of ERAS gene in tumorigenic MDA-MB-231 cells gene generated larger, faster growth and more undifferentiated tumors than control cells. Taken together, these evidences support that ERAS may promote malignant progress in breast cells by activation of EMT and acquiring stem cells properties.

1. Ferlay J SI, et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2013.


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