dianas 5(1) > Esteban-Rubio etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160363

IDH1 gDNA sequences detected in liquid biopsies from GBM patients.

Susana Esteban-Rubio^1, a, Josefa Carrión-Navarro², Noemí García-Romero³, Ricardo Prat-Acín⁴, Carlos Fernández-Carballal⁵, Cristobal Belda-Iniesta^2, 3, Angel Ayuso-Sacido^1, 2, 3

1. Universidad San Pablo CEU, Madrid, Spain.  2. Fundación Hospital de Madrid-IMMA, Madrid, Spain.  3. IMDEA Nanoscience, Madrid, Spain.  4. Hospital Universitario la Fe, Valencia, Spain.  5. Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid, Spain.

a. susana.rubio91@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Keywords: GLUT4, DM2, ILK, striated muscle, insulin resistance, metabolic syndrome; Abstract

Abstract

BACKGROUND. Diffuse gliomas are the most common malignant primary tumors, and Glioblastoma (WHO grade IV) is the most frequent diffuse glioma with a median patient survival of 15 months after diagnosis. Temozolomide (TMZ) and radiotherapy is currently the first-line of treatment for this disease, however, survival remains poor among these patients because of resistance to TMZ. The identification and validation of biomarkers for prosgnostic and responsed to therapy values, using minimally invasive approaches, along the course of the disease, will significalntly improve the management of these tumors. In this sense, the use of liquid biopsies would allow to for the monitoring of tumor changes in real time. Thereby, glioma cell extracellular vesicles (EVs) containing mRNA, gDNA or proteins, can cross the Blood Brain Barrier reaching the peripheral blood, from where they can be isolated and their cargo analysed. Somatic mutations at codon 132 of the isocitrate dehydrogenase 1 gene (IDH1) have been identified in approximately 12% of glioblastomas. This subgroup of patients display better prognostic, with improved overall survival. Our group have recently detected IDH1 gDNA sequences within EVs isolated from either tumor cells or EVs isolated from peripheral blood of athymic mice xenografted with cancer-initiating cells. RESULTS AND CONCLUSION. We have studied the IDH1 sequence of EVs-isolated gDNA of peripheral blood samples from patients diagnosed with different degree of gliomas, together with controls. The results were validated by analysing the IDH1 sequence within the counterpart paraffin-embedded solid tumor specimens. Here we show a proof of concept for the use of the IDH1 mutations within peripheral blood EVs, as a prognostic biomarker via a minimally invasive technique.

dianas 5(1) > Segovia-de-Andrés etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160362

Opposing roles of PIK3CA gene alterations to EZH2 signaling in Non-Muscle Invasive Bladder Cancer.

Cristina Segovia de Andrés, Mónica Martínez-Fernández, Marta Dueñas, Carolina Rubio, Fernando F López-Calderón, Clotilde Costa, Cristina Saiz-Ladera, María Fernández-Grajera, José Duarte, Jose L Rodriguez-Peralto, Federico de la Rosa, Felipe Villacampa, Daniel Castellano, Jesús M Paramio

1. Unidad de Oncología Molecular, CIEMAT. Avda Complutense 40, 28040 Madrid.  2. Grupo Oncología Molecular, Instituto de Investigación 12 de Octubre. Avda de Córdoba, s/n. 28041 Madrid.  3. Departamento de Urología, Hospital “12 de Octubre” Avda de Córdoba, s/n. 28041 Madrid.

a. cristina.segovia@ciemat.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Keywords: PI3K; EZH2; non-muscle invasive; bladder cancer

Abstract

Bladder cancer (BC) is a current challenging problem in the clinics. At diagnose, it can appear in two different pathological forms. The non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) represents 70% of BC cases and is treated by transurethral resection. However, they also show one of the highest rates of recurrence, which in some cases can progress into aggressive muscle-invasive tumors (MIBC). This requires a regular surveillance making NMIBC one of the most costly malignancies to health care systems in developed countries [1]. Moreover, there are not effective therapies for MIBC, besides cystectomy followed by conventional chemotherapy, which is still ineffective. Therefore is required the identification of biomarkers that may help to determine recurrence and possible progression in NMIBC. We previously demonstrated that PIK3CA gene alterations are extremely frequent in NMIBC, being present in non-affected bladder tissue, and predicted low recurrence and progression [2]. On the other hand, genomic profiling indicated that gene expression mediated by increased EZH2 expression, were associated with increased recurrence and progression [3]. The different clinical evolution of tumors characterized by either PIK3CA gene alterations, or increased expression and activity of EZH2, led us to hypothesize that these two pathways may exert opposite roles in NMIBC. Here, we report that molecular evidences using clinical samples and BC cell lines, that PI3K-dependent signaling negatively regulates EZH2-dependent processes. We demonstrate that PIK3CA alterations mediate increased expression of two miRNAs, miR-101 and miR-138, which post-transcriptionally downregulate EZH2 expression. In addition, the PIK3-dependent signaling activates Akt, which in turn phosphorylatesEZH2 on Ser21, which produces decreased H3K27 methyl transferase activity. These observations could help to define better clinical intervention protocols for NMIBC management.

1. Burger M, Oosterlinck W, Konety B, Chang S, Gudjonsson S, Pruthi R, et al. 2013. ICUD-EAU International Consultation on Bladder Cancer 2012: Non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder. European urology. 63:36-44.


2. Duenas M, Martinez-Fernandez M, Garcia-Escudero R, Villacampa F, Marques M, Saiz-Ladera C, et al. 2013. PIK3CA gene alterations in bladder cancer are frequent and associate with reduced recurrence in non-muscle invasive tumors. Mol Carcinog. 54:566-76.


3. Santos M, Martinez-Fernandez M, Duenas M, Garcia-Escudero R, Alfaya B, Villacampa F, et al. 2014. In vivo disruption of an Rb-E2F-Ezh2 signaling loop causes bladder cancer. Cancer Res. 74:6565-77.

dianas 5(1) > Arranz-Nicolás etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160361

Role of diacylglycerol kinase alpha (DGKα) in T cells tolerance regulation and tumor evasion.

Javier Arranz Nicolás, Antonia Ávila Flores, Isabel Mérida de San Román

Lipid Signaling Laboratory, Department of Immunology and Oncology, National Center of Biotechnology (CNB-CSIC).Darwin 3, 28049, Madrid.

a. jarranz@cnb.csic.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Abstract

Diacylglycerol kinase α is an enzyme highly expressed in mature T cells, where acts as a negative regulator by consuming Diacylglycerol (DAG). This DGKα role promotes hypofunctional immune response or anergy. DAG is generated in response to lymphocytes activation through their receptor (TCR), G protein-coupled receptors (GPCRs) or different kind of receptors. This molecule facilitates the activation of the Ras/ERK cascade. In tumors, the recruitment of immune cells with suppressive capacity and the characteristics of the tumor microenvironment (increased levels of adenosine, low oxygen and acidic pH) favor that T cells become anergic and that the activation of the TCR does not occur or occurs in a deficient manner. In this situation the transcription of certain genes, including DGKα gene, is promoted. In addition, tumors express high levels of DGKα, suggesting a positive role for this enzyme in these cells. Together these data indicate that DGKα could be relevant as a pharmaceutical target to block tumor growth and enhance T cell immunity. Based on this our main objective is the design and optimization of robust and reproducible trials in order to apply them for screening processes. To reach this objective we have developed and optimized sensors for DGKα activity through the Ras/ERK signaling axis that could be used as a control, both in normal activation and in presence of a positive compound working as an inhibitor of the enzyme. We will describe the optimization of different kind of assays including biochemical analysis, transcription reporter studies, imaging based assays and protein surface analysis by flow cytometry.

dianas 5(1) > González-Corpas etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160355

SHP-1 controla la expresión génica mediante la regulación de las modificaciones epigenéticas.

Ana González Corpas, María Jesús Orea Martínez, Begoña Colás, Santiago Ropero

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. agcorpas@gmail.com  b. oreamariajesus@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: cáncer de próstata; SHP-1; epigenética; HDAC2

Resumen

SHP1 es una fosfotirosina fosfatasa (PTP) que se expresa principalmente en células hematopoyéticas [1] aunque también se ha descrito su presencia en tejidos sólidos como la próstata. Aunque esta proteína tiene una localización fundamentalmente citosólica, nuestro grupo ha demostrado que en líneas celulares de cáncer de próstata también está presente en el núcleo [2], y que aquí podría controlar la expresión génica. Una de las funciones de las modificaciones epigenéticas es la regulación de la expresión génica. Las modificaciones epigenéticas mejor conocidas son la metilación del DNA y las modificaciones post-traduccionales de las histonas. En este trabajo nos propusimos determinar si SHP-1 regula la expresión génica mediante cambios en la metilación del DNA. Para ello, determinamos el estado de metilación de 1507 CpGs correspondientes a 807 genes en las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y PC3 en las que se anuló la expresión de SHP1 mediante siRNA. De estos ensayos seleccionamos un grupo de genes en los que la ausencia de SHP1 provoca una disminución de los niveles de metilación, concretamente GSTP1, RUNX1T1, NPY, HIN-1 y KIT. Dado que la metilación del DNA en la región promotora de los genes es una marca epigenética que se relaciona con la pérdida de expresión [3], a continuación se determinaron los niveles de mRNA de los genes seleccionados mediante qRT-PCR y observamos que la perdida de metilación se correlacionó con un aumento en la expresión. El tratamiento de las células LNCaP con el agente desmetilante 5-aza-2-deoxicitidina confirmó que los cambios en la expresión observados se deben a cambios en la metilación ya que produjo un aumento en la expresión de los genes seleccionados. Además, el tratamiento de las células LNCaP con SAHA, un inhibidor de histonas desacetilasas, provocó un aumento de la expresión de dichos genes. Todas las modificaciones epigenéticas cooperan en la regulación de la expresión, y en concreto la metilación del DNA va asociada con la pérdida de acetilación de las histonas en el promotor de los genes que no se expresan [4], por lo que a continuación determinamos el estado de acetilación de las histonas en los promotores de los genes seleccionados y observamos que el aumento en la expresión se correlaciona con una mayor acetilación de las histonas en la región promotora de estos genes. A la vista de estos resultados nos planteamos si SHP1 podría esta interaccionando con proteínas que regulan las modificaciones epigenéticas, especialmente, proteínas encargadas de mantener la metilación del DNA y el estado de acetilación de las histonas y de esta manera estar influyendo en la expresión génica. Para ello realizamos ensayos de “Pull Down” (PD) y observamos una interacción entre SHP1 y HDAC2, proteína encargada de la desacetilación de histonas [5]. Para comprobar si lo observado mediante PD se reproducía en un ensayo in vivo se realizarón ensayos de coinmunoprecipitación (IP) con los que se confirmó lo que ya habíamos observado mediante PD. En conclusión, nuestros datos indican que en líneas celulares de cáncer de próstata SHP1 podría regular la expresión de genes con importantes funciones en el mantenimiento de la homeostasis celular mediante el control de las modificaciones epigenéticas. Este efecto podría estar mediado por su interacción con HDAC2 que estaría provocando cambios en la acetilación de las histonas en el promotor de los genes seleccionados y por tanto sería el responsable de los cambios en la metilación observados.

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dianas 5(1) > Orea-Martínez etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160354

Papel de la metilación del DNA en el desarrollo de resistencia del cáncer de próstata a los tratamientos hormonales.

María Jesús Orea Martínez, Ana González Corpas, Begoña Colas Escudero, Santiago Ropero Salinas

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. oreamariajesus@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: cáncer de próstata; receptor de andrógenos; modificaciones epigenéticas; metilación del DNA; bloqueo hormonal

Resumen

El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte entre los hombres en los países desarrollados. La mayoría de los tumores de próstata son dependientes de andrógenos en el momento del diagnóstico, de ahí que uno de los tratamientos clásicos sea el bloqueo hormonal mediante la ablación androgénica con agonistas de la hormona luteinizante (LHRH). Aunque prolonga la supervivencia, la respuesta a estos tratamientos es limitada y de forma casi invariable los pacientes desarrollan resistencia al bloqueo hormonal continuado [1,2]. Los cambios en las modificaciones epigenéticas juegan un papel decisivo en el desarrollo y progresión del cáncer así como en el desarrollo de la resistencia de los tumores a los tratamientos convencionales [3]. En este trabajo nos propusimos analizar el papel de la metilación del DNA en el desarrollo de resistencia de los tumores de próstata al bloqueo hormonal. Para ello hemos comparado el perfil de metilación de las células LNCaP, que expresan el receptor de andrógenos (RA) y responden a los tratamientos hormonales, y las LNCaP abl, que no responden al tratamiento hormonal pero siguen expresando el RA [4], mediante un array que permite determinar el estado de metilación de más de 450.000 CpGs distribuidas a lo largo de todo el genoma. De estos ensayos hemos seleccionado un grupo de genes siguiendo dos criterios: que presente diferencias de metilación y su funcionalidad celular. Atendiendo al primer criterio se han seleccionado dos grupos de genes, el primero que incluye los genes que se encuentran hipermetilados en las células LNCaP abl con respecto a las LNCaP (CLDN3, CEBPD, BSCL2 y MARCKS) y un segundo grupo donde los genes seleccionados (MPP1 y ESR1) se encuentran hipometilados en la línea LNCaP abl. En cuanto a su funcionalidad, estos genes intervienen en procesos tan importantes como son las uniones estrechas entre células (CLDN3) [5]; en la diferenciación celular (BSCL2) [6]; en la respuesta inmune e inflamatoria (CEBPD) [7]; en la regulación del citoesqueleto de actina (MARCKS) [8], en la proliferación celular (MPP1) [9] y en el desarrollo sexual (ESR1) [10]. En primer lugar se validaron los datos obtenidos en el array, mediante PCR específica de metilación (MSP), y secuenciación del DNA tratado con bisulfito de la región promotora de los genes seleccionados. Dado que la metilación del DNA en la región promotora de los genes es una marca epigenética que se relaciona con la pérdida de expresión [11], se determinaron los niveles de mRNA de los genes seleccionados mediante qRT-PCR y observamos que la expresión de los genes CLDN3, CEBPD, MARKS, BSCL2 disminuye en las células LNCaP abl en las que están metilados, mientras que la expresión de los genes hipometilados (MPP1 y ESR1) en esta línea aumentó con respecto a las células LNCaP. Por último, para confirmar que los cambios en la expresión observados en los genes seleccionados se deben a los cambios en la metilación del promotor, tratamos las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP abl y LNCaP con el agente desmetilante 5-aza-2-deoxicitidina. Este tratamiento produjo un aumento de la expresión de los genes CLDN3, CEBPD y MARKS en las células LNCaP abl y no la modificó en las células LNCaP. Lo contrario ocurrió con los genes que pierden metilación, el tratamiento solo aumentó su expresión en las células LNCaP. En conclusión, en este trabajo hemos identificado un grupo de genes cuya expresión está regulada por cambios en el estado de metilación de su región promotora en líneas celulares de cáncer de próstata que no responden a andrógenos y que, dada su función, podrían tener un papel relevante en el desarrollo de resistencia de los tumores de próstata a los tratamientos hormonales.

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dianas 5(1) > Zarka-Trigo y Roldan

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160353

Señalización celular post-eyaculación de los espermatozoides de mamíferos.

Daniel Zarka Trigo, Eduardo Roldan

Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC. Calle de José Gutiérrez Abascal, 2, 28006 Madrid.

a. dr.zarkajr@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: capacitación; fertilización; espermatozoides; señalización celular REDOX; ROS; espermatología

Resumen

Los espermatozoides son un tipo celular muy excepcional en el campo de la señalización celular, debido a que son células germinales y poseen el núcleo haploide, muy compactado y aparentemente inactivo. A diferencia de en otras especies animales, las hembras de mamíferos no disponen de una espermateca que mantenga a los espermatozoides con vida hasta el momento de la fertilización. Por ello, y para evitar la muerte celular prematura, los espermatozoides de mamíferos se almacenan en el epidídimo sin estar completamente maduros. Por lo tanto estos espermatozoides requieren de una fase de maduración post-eyaculado para desarrollar su potencial fertilizador [1, 2]. A este proceso se le denomina capacitación, e incluye una serie de cambios metabólicos, fisiológicos y funcionales fuertemente regulados por diversas vías de señalización [1, 3-5]. Entre los cambios fisiológicos más notables se encuentran la reorganización de la membrana plasmática, que otorga al espermatozoide la capacidad de reconocer al ovocito y fusionarse con él [5, 6], cambios en el patrón de natación (hiperactivación) del espermatozoide [7, 8] y la preparación del espermatozoide para la reacción acrosómica, previa a la fusión del mismo con el óvulo [9, 10]. El estudio de la señalización celular de la capacitación está en auge, y varios grupos de investigación están demostrando las complejas vías de señalización de este importante proceso. Se ha determinado que la capacitación requiere inicialmente la pérdida de diversas moléculas de la superficie espermática, como son el colesterol, determinadas proteínas y de otras moléculas (Zn, Sg), permitiendo con ello la reorganización de la membrana plasmática y la aparición de proteínas transmembrana que intervienen en la señalización celular [6, 11, 12]. En segundo lugar se da la aparición de AMPc por medio de la activación de la adenilato ciclasa y por ello, la activación de proteínas kinasas (PKA y PKC) [1, 12-16]. La activación de proteínas kinasas es responsable de la posterior activación de diversas cascadas de señalización como las MAP-Kinasas, AKAPs, Pi3K/Akt, ERK, Ras/Raf, etc [17, 18]. Las publicaciones más recientes sugieren la participación de las especies reactivas derivadas del oxígeno (ROS) y derivadas del nitrógeno (NOS), como segundos mensajeros de la señalización celular de la capacitación [3, 17-20]. También se indica que el parecido de la vía de señalización de la capacitación con las vías de la señalización propias de la apoptosis de células somáticas, define una estrategia en la que la programación celular típica de los espermatozoides fuera principalmente su muerte, salvo que el encuentro con ciertas señales del aparato reproductor femenino conduzca a la adquisición de su potencial fertilizador y la fecundación del óvulo [21].

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dianas 5(1) > Sosa-Callejas etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160352

Papel de la hiperfosfatemia en la sarcopenia: Homeostasis proteica y senescencia.

Patricia Sosa Callejas, Nuria Troyano, Inés Mora, Diana Medrano, Patricia Plaza, Mercedes Griera, Marco Hatem, Gemma Olmos, Susana López, María Piedad Ruiz-Torres

1. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud. Universidad de Alcalá and Unidad de investigación.  2. RedinRen, Instituto de Salud Carlos III. Madrid. Spain.  3. Fundación para la Investigación Biomédica, Hospital Príncipe de Asturias. Alcalá de Henares.

a. patricia.sosacalle@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: Sarcopenia; senescencia; hiperfosfatemia; mioblasto; enfermedad renal crónica

Resumen

INTRODUCCIÓN. Se ha descrito un aumento en la concentración sérica de fosfato en la enfermedad renal crónica y en el envejecimiento. Una patología asociada en ambos casos es la sarcopenia, caracterizada por la pérdida de masa y fuerza muscular, que puede ser debida, en parte, a la pérdida de la capacidad regenerativa en el músculo. El objetivo del trabajo fue estudiar si la hiperfosfatemia induce la pérdida de la capacidad regenerativa muscular debido al aumento de la senescencia de los mioblastos y los mecanismos implicados en este fenómeno. MATERIALES Y MÉTODOS. Se utilizaron mioblastos C2C12 de ratón en cultivo. Las células fueron tratadas con 10 mM de β-glicerofosfato (BGP) durante 24, 48 o 72 horas como donador de fósforo extracelular. Se analizó la expresión de genes de senescencia como p16, p21 y p53 mediante western blot. El porcentaje de células senescentes identificado por la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia, fue analizado por microscopia confocal utilizando el substrato, 5-dodecanoylaminofluoresceina di-beta-D-galactopyranosido. Para demostrar una relación directa entre hiperfosfatemia y senescencia se utilizó ácido fosfonofórmico, inhibidor del transportador Na-Pi. Se estudió el efecto del BGP sobre los distintos sistemas de degradación proteica, midiendo la actividad del proteosoma, mediante el uso de un sustrato fluorogénico específico, y la autofagia, analizando los niveles de expresión de p62 y LC3I respecto a LC3II, mediante western blot. La actividad total de calpainas, mediante el uso de un sustrato fluorogénico específico y la expresión de calpainas 1, 2 y 3 analizada por western blot. Para establecer si el efecto sobre los sistemas de degradación proteica fue responsable de la senescencia inducida por BGP se midió está en presencia de 1uM calpeptina, inhibidor de calpainas, y 50nM de rapamicina, activador de la autofagia. RESULTADOS. BGP incrementó la expresión de p53, así como el porcentaje de células senescentes. El uso del ácido fosfonofórmico suprimió este incremento durante el tratamiento con BGP, lo que indica que la senescencia fue dependiente del aumento de BGP. Se observó que el BGP induce una disminución de la actividad del proteosoma y un aumento de p62 y LC3I/LC3II, lo que se corresponde con una disminución de la autofagia. Respecto a la actividad total y la expresión de calpainas 1, 2 y 3 el BGP induce un incremento en ambos valores. La adición de calpeptina inhibió el aumento en p53, lo que indica que la vía de las calpainas está relacionada con el efecto senescente del BGP. Cuando se procedió a la activación de la autofagia con rapamicina se comprobó que no se producían los aumentos de genes senescentes con BGP, indicando que la autofagia jugó un papel central en la inducción de la senescencia. CONCLUSIÓN. El aumento en la concentración de fósforo extracelular induce senescencia en los mioblastos de musculo esquelético, estas células muestran un incremento en la actividad de calpaina y una disminución de la actividad proteolítica del proteosoma y la autofagia. Esta alteración en la homeostasis de proteínas está implicada en la inducción de senescencia en los mioblastos y este podría ser un mecanismo involucrado en la progresión de la sarcopenia ligada a envejecimiento o enfermedad renal crónica.

1. N. Troyano et al. Hyperphosphatemia induces cellular senescence in human aorta smooth muscle cells through integrin linked kinase (ILK) up-regulation. Mechanisms of Ageing and Development, 2015


2. S. Burattini et al. C2C12 murine myoblast as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry, 2004.


3. Nasser Al-Shantia et al. Activated Lymphocytes Secretome Inhibits Differentiation and Induces Proliferation of C2C12 Myoblasts. Cell Physiol Biochem 2014; 33:117-128

dianas 5(1) > de-la-Usada-Molinero etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160351

NONADICTINA, un tratamiento teórico para la adicción.

Eduardo de la Usada Molinero, Fernando Fernández García, Laura Martín Díaz, Javier Merino Valverde, Lorena Torres Valle

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. edu231288@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: ΔFosB; adicción; cocaína; siRNA; liposomas

Resumen

España lidera el ranking mundial en consumo de cocaína según el Observatorio Europeo de las Drogas y las Toxicomanías. El consumo crónico de esta sustancia conlleva unos efectos que derivan en una adicción que impide al enfermo llevar una vida normal, pues se imponen unas pautas comportamentales a través de la vía de recompensa cerebral que le dirigen a la búsqueda compulsiva de la droga. Por esta razón es más importante encontrar un tratamiento que ayude al paciente a superar esta situación que uno que palíe los síntomas del síndrome de abstinencia. La cocaína bloquea la recaptación de dopamina a nivel de la sinapsis entre la neurona presináptica dopaminérgica del área tegmental ventral y la neurona postsináptica del núcleo accumbens, aumentando la estimulación por dopamina en éste último, el cual está relacionado con fenómenos de recompensa. La dopamina se une a sus receptores de tipo D1, produciendo la activación o la represión transcripcional de distintos genes, donde juega un papel primordial el factor transcripcional ΔFosB, y la activación de la vía de las MAPK [1]. A largo plazo, la acumulación patológica de ΔFosB conduce a una expansión de dendritas neuronales y a una disminución en la expresión de dinorfina, opioide endógeno implicado en la regulación negativa de la estimulación dopaminérgica. Distintos autores relacionan estos hechos con un aumento de los mecanismos de recompensa que conducen finalmente a la adicción [2]. En este trabajo proponemos un hipotético tratamiento para la adicción a la cocaína basado en el conocimiento de las vías de señalización que desencadenan su consumo crónico. De las posibles dianas terapéuticas implicadas en la adicción, consideramos potencialmente útiles: los receptores de tipo D1, para los cuales se haría un análogo de la droga; y ΔFosB, variante de splicing de FosB que se acumula debido a su elevada estabilidad. Decidimos actuar sobre ΔFosB porque su acumulación parece ser la responsable directa de la adicción. FosB solo se diferencia de ΔFosB en que éste carece de los 101 aminoácidos del extremo C-terminal [3]; por lo que en vez de orientar nuestra terapia contra la proteína, lo cual sería poco específico, la dirigimos contra el RNA mensajero que codifica para ΔFosB. Diseñamos un siRNA específico de ΔFosB aprovechando las características diferenciales de su secuencia. Para ejercer su efecto sería necesario que atravesara la barrera hematoencefálica, para lo cual proponemos el empleo de liposomas catiónicos pues ya han demostrado su eficacia previamente [4]. Para probar la eficacia del tratamiento planteamos estudios in vitro e in vivo. Cabría esperar una disminución de ΔFosB a niveles basales con el tiempo, ya que el siRNA inhibe la síntesis de nuevo ΔFosB pero no actúa sobre el ya formado. El tratamiento daría lugar a una neuroadaptación que ayudaría a acelerar la recuperación en la rehabilitación y sería eficaz frente a recaídas. Dado que ΔFosB solo se encuentra alterado en patologías, su inhibición no debería tener efectos adversos, aunque no debemos descartar posibles efectos inespecíficos debidos al propio siRNA o a la formulación. Sería interesante administrar una terapia combinada a los pacientes, suplementando el tratamiento de siRNA con otros fármacos como agonistas los receptores de tipo D1 de dopamina y/o antidepresivos [5]. Por último, cabe destacar que el tratamiento propuesto podría ser eficaz para otras adicciones, pues todas convergen en la vía de recompensa y tienen en común la acumulación de ΔFosB.

1. Ron D, Jurd R. 2005. The ‘ups and downs’ of signaling cascades in addiction. Sci STKE. 2005(309):re14


2. Nestler EJ. 2013. ΔFosB: a Molecular Switch for Reward. J Drug and Alcohol Research. 2(2013):art235651.


3. Ruffle JK. 2014. Molecular neurobiology of addiction: what’s all the (D)FosB about? Am J Drug Alcohol Abuse. 40(6):428-437


4. Pulford B, Reim N, Bell A, Veatch J, Forster G, et al. 2010. Liposome-siRNA-Peptide Complexes Cross the Blood-Brain Barrier and Significantly Decrease PrPC on Neuronal Cells and PrPRES in Infected Cell Cultures. PLoS ONE. 5(6):e11085.


5. Quednow BB, Herdener M. 2015. Human pharmacology for addiction medicine: From evidence to clinical recommendations. Prog Brain Res. 224:227-50

dianas 5(1) > Pérez-Hernández etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160343

Implicación de MMP-9 en los cambios de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la formación de edema inducidos por MDMA en la rata.

Mercedes Pérez-Hernández, Ana Rubio-Araiz, María Dolores Gutiérrez-López, Esther O’Shea Gaya, M Colado Megía

1. Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Madrid (España).  2. Trinity College Institute of Neuroscience, Dublin (Irlanda).

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: MDMA; barrera hematoencefálica; MMP-9; edema; SB-3CT; receptores P2X7

Resumen

La droga de abuso 3,4-metilenodioximentanfetamina (MDMA) es un psicoestimulante de uso social cuyo consumo va dirigido a la obtención de una sensación de euforia y apertura emocional. La administración periférica de MDMA en ratas produce, entre otras manifestaciones, una respuesta neuroinflamatoria caracterizada por la activación microglial. La integridad de la barrera hematoencefálica (BHE) es imprescindible para la homeostasia del sistema nervioso central (SNC) y puede ser alterada por los procesos inflamatorios. Las citoquinas proinflamatorias y las especies reactivas de oxígeno son capaces de activar metaloproteinasas (MMPs) implicadas en la degradación de componentes proteicos de la BHE. El incremento de la permeabilidad de la BHE producido de este modo puede desencadenar la entrada de agua desde la sangre y su acumulación en el tejido formando edema. El presente estudio revela la alteración de la BHE y la consecuente generación de edema en el hipocampo de la rata, tras la administración periférica de una única dosis de MDMA. Concretamente, produce una disminución en la expresión de la proteína de las uniones estrechas, claudina-5 y de la laminina de la matriz extracelular, además de la sobreactivación de MMP-9. El pretratamiento con SB-3CT, un inhibidor de la actividad MMP-9, previene tanto la disminución de claudina-5 como la generación de edema y la sobreexpresión de canales de agua AQP4 encargados de su resolución. Esto confirma la implicación directa de MMP-9 en la alteración de la BHE inducida por MDMA. La activación microglial mediada por receptores P2X7 es la responsable del incremento en la actividad de MMP-9, como indica su ausencia tras el pretratamiento con Brilliant Blue G, un antagonista de dichos receptores. Estos resultados, además de contribuir al esclarecimiento del mecanismo de acción de la MDMA, son relevantes debido al hecho de que la alteración de la BHE supone un factor de vulnerabilidad para el SNC.

dianas 5(1) > Abuin etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160342

A single neurotoxic dose of MDMA increases kynurenine pathway metabolism in plasma and hippocampus of rat.

Cristina Abuin, Rebeca Vidal, María Dolores Gutiérrez, Esther O’Shea, María Isabel Colado

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Spain.

a. camartinez@ucm.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Keywords: MDMA; kynurenine pathway; rat hippocampus; serotonin; HPLC

Abstract

Introduction: The kynurenine pathway is the main route of tryptophan metabolism and under physiological conditions, it is responsible for over 95% of tryptophan degradation in mammals. Tryptophan is converted into the first stable molecule of the pathway, kynurenine, through the action of the enzymes tryptophan 2,3-dioxygenase and indoleamine 2,3-dioxygenase. The pathway is divided into two branches, one of which forms kynurenic acid by means of kynurenine aminotransferases, and the other of which, by the action of kynurenine mono-oxygenase, gives rise to 3-hydroxykynurenine, a precursor of the neurotoxin quinolinic acid. Kynurenine, kynurenic acid and quinolinic acid have been implicated in various neurological and neurodegenerative disorders [1]. 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA, ‘ecstasy’) is an amphetamine derivative that produces serotonergic neurotoxicity [2] and neuroinflammation manifested as increased production of interleukin-1β and microglial activation [3]. Objective: The aim of this study was to evaluate possible changes in the levels of major kynurenine pathway metabolites following MDMA administration. Materials and methods: Male Dark Agouti rats received a single neurotoxic dose of MDMA (12.5 mg/kg, i.p.) and were sacrificed 1 h, 3 h, 6 h, 24 h or 7 days later. Plasma and hippocampal concentrations of serotonin, tryptophan, kynurenine and kynurenic acid were measured by high pressure liquid chromatography. The ratios of serotonin/tryptophan and kynurenine/tryptophan were also calculated as an index of the activity of the enzymes involved in the metabolism of tryptophan. Results: MDMA increases hippocampal concentrations of tryptophan 1 h and 3 h after administration, returning to control concentrations at 6 h. No differences in plasma concentrations of tryptophan occur at any of the times measured compared with the control group. Kynurenine concentrations are also raised in hippocampus 1 h, 3 h and 6 h after MDMA as are the plasma concentrations 3 h and 6 h after drug administration. Furthermore, in hippocampus the kynurenine/tryptophan ratio is increased only 6 h after MDMA whereas in plasma, an increase is observed after 1 h, 3 h and 6 h. MDMA raises kynurenic acid concentrations at 6 h in hippocampus and at 3 h in plasma. Serotonin concentrations decrease in hippocampus at all the time-points evaluated, and in plasma at 3 h and 6 h. The serotonin/tryptophan ratio also decreases in hippocampus at all the times measured but only at 3 h and 6 h in plasma. Conclusions: Administration of a neurotoxic dose of MDMA in Dark Agouti rats leads to an imbalance of the kynurenine pathway, resulting in an increase in the kynurenine/tryptophan ratio in plasma and hippocampus reflecting an increase in IDO activity.

1. Chen Y, and Guillemin GJ (2009). Kynurenine pathway metabolites in humans: disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research 2: 1-19.


2. O'Hearn E, Battaglia G, De Souza EB, Kuhar MJ, and Molliver ME (1988). Methylenedioxyamphetamine (MDA) and methylenedioxymethamphetamine (MDMA) cause selective ablation of serotonergic axon terminals in forebrain: immunocytochemical evidence for neurotoxicity.The Journal of Neuroscience 8: 2788-03.


3. Torres E, Gutierrez-López MD, Borcel E, Peraile I, Mayado A, O’Shea E and Colado MI (2010). Evidence that MDMA (‘ecstasy’) increases cannabinoid CB2 receptor expression in microglial cells: role in the neuroinflammatory response in rat brain. Journal of Neurochemistry. 113: 67-78.