dianas 5(1) > Albarrán etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e201603A1

Cribado mediante un ensayo bioquímico de librerías de compuestos para la identificación de inhibidores de la quinasa CDK8/CICLINA C.

María Isabel Albarrán, Antonio Cebriá, Natasha Zarich, Oliver Renner, Ana Belén García, Sonsoles Rodríguez, Rosario Concepción Riesco, Ana Isabel Hernández, Virginia Rivero, Rosa María Alvarez, Manuel Urbano, Sonia Martínez, Joaquín Paston, Carmen Blanco-Aparicio

CNIO.

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Resumen

Actualmente las estrategias empleadas en la búsqueda de nuevas terapias antitumorales están orientadas y dirigidas hacia una diana concreta mediante la búsqueda de moléculas pequeñas que modulen dianas implicadas en rutas de señalización celular esenciales para la progresión tumoral. El complejo CDK8/CYCLINAC es una quinasa perteneciente a la familia de las quinasas dependientes de ciclinas, que pertenece al grupo de quinasas que fosforilan el dominio C-terminal de la RNA polimerasa II regulando de este modo la transcripción. CDK8/CYCLINAC forma parte del complejo multi-proteico denominado “Mediator”, dentro de este complejo junto con los componentes MED12 and MED13 forman el denominado dominio quinasa que acompleja la acción de factores de transcripción con la maquinaria molecular que lleva a cabo la transcripción La desregulación de la vía Wnt/β-catenina desempeña un papel central en el cáncer de colon y CDK8 ha sido identificado como un oncogén transcripcional en este tipo de tumores, Estudios publicados indican que la sobreexpresión y actividad quinasa de CDK8 podrían ser el desencadenante de la la progresión y agresividad del cáncer colorectal y ser indicador de un mal pronóstico de la enfermedad. Por otra parte también se ha determinado que CDK8 se expresa de manera significativa en adenoma gástrico y su expresión es mayor en adenocarcinoma gástrico. Mediante microarrays se ha correlacionado la expresión CDK8 con baja supervivencia en cáncer de mama y de ovario. Por todo ello, iniciamos un proyecto de desarrollo de fármacos para la identificación y optimización de inhibidores de CDK8/CICLINA C para su posible aplicación terapéutica en cáncer ya sea como agente único o en combinación con terapias existentes. En nuestro proyecto para la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos, desarrollamos y validamos un ensayo bioquímico de “Binding” usando la tecnología “Lanthascreen” para estudiar la actividad quinasa de CDK8/CICLINA C y usarlo para medir la inhibición de la enzima purificada. También se desarrolló un ensayo para evaluar la inhibición celular de CDK8 que mide la modulación de la actividad transcripcional de β-catenina en la línea HCT116 de cáncer de colon que sobrexpresa CDK8. Tras la puesta a punto del ensayo bioquímico, realizamos una campaña de cribado de compuestos químicos, utilizando dos librerías diferentes. En primer lugar se hizo un escrutinio enfocado de 1090 compuestos seleccionados de la librería de 50000 compuestos del CNIO. Este escrutinio se realizó por duplicado a una concentración de 10 M, se estableció un punto de corte del 50% de inhibición y se identificaron 129 compuestos que se confirmaron en ensayos de dosis respuesta, de los cuales 40 compuestos presentaron una IC50 inferior a 0.5 M. Estas moléculas pertenecían a diferentes series químicas con y sin propiedad intelectual y por ello se seleccionaron 5 “hits” para hacer química y generar nuevos moléculas más potentes y con propiedad intelectual. Esta fase de generación de nuevos ”hits” dio lugar a 8 series químicas con propiedad intelectual, que se caracterizaron a nivel de potencia, selectividad frente a otras quinasas (un panel de 24 representantes de las diferentes familias del quinoma) y estudios ADME in vitro como, solubilidad cinética, permeabilidad y estudios de inestabilidad microsómica. En base a todos estos criterios se seleccionó la serie química 5 con la cual en la actualidad estamos en una fase de “hit to lead”. Se realizó una segundo escrutino , esta vez con un objetivo de reposicionamiento y para ello se utilizó una librería de 1539 compuestos procedente de la Johns Hopkins University (JHU) , que contiene fármacos ya aprobados en clínica con diferentes aplicaciones. La campana también se realizó a doble punto y 1 M, se estableció un punto de corte del 70% de inhibición y se seleccionaron 15 compuestos para los que se determinó su IC50 bioquímico y su EC50 en el ensayo celular, pero a pesar de ser potentes bioquímicamente no dieron actividad celular y por ello no se progresaron.

dianas 5(1) > Reventún etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160364

Regulación de ILK en la aterosclerosis.

Paula Reventún, Irene Cuadrado, Marta Saura

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871, Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. reventuntorralba@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: óxido nítrico (NO); quinasa ligada a integrinas (ILK); inflamación; daño vascular; óxido nítrico sintasa inducible

Resumen

La aterosclerosis es una patología multifactorial con un claro componente inflamatorio y que se desarrolla prioritariamente en zonas de desequilibrio hemodinámico. Los cambios de flujo que sufren los vasos se transmiten por la pared vascular gracias a mecanotransductores como las integrinas. Éstas contactan con la Quinasa Ligada a Integrinas (ILK) regulando el tono vasomotor convirtiéndola en diana terapéutica para el tratamiento de la aterosclerosis. Hemos observado que la expresión de ILK está disminuida en arterias ateroscleróticas humanas, coincidiendo con un aumento de la activación de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Así, hipotetizamos que NO producido por la activación de iNOS regula niveles de ILK. Tratando Células Endoteliales de Aorta Murina (MAEC) con la citoquina proinflamatoria TNFα, se activa iNOS y disminuye la expresión de ILK. El tratamiento con un donador de NO produce disminución de ILK tiempo-dosis dependiente que no responde a un defecto transcripcional sino que afecta a la estabilidad de la proteína. El NO disminuye la estabilidad de ILK, promoviendo su ubiquitinación. Sin embargo el proteasoma no interviene en la degradación porque inhibiéndolo farmacológicamente, esta no revierte. Se demuestra que la degradación de ILK inducida por NO se produce en los lisosomas pues ILK y el marcador lisosomal LAMP-1/2 interaccionan, ILK puede visualizarse en los lisosomas y el tratamiento con cloroquina, inhibidor de la actividad lisosomal, revierte los efectos de NO sobre ILK. Concluyendo que NO derivado de iNOS regula los niveles de ILK durante la aterosclerosis favoreciendo su ubiquitinación y posterior degradación por la via de los lisosomas.

dianas 5(1) > Esteban-Rubio etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160363

IDH1 gDNA sequences detected in liquid biopsies from GBM patients.

Susana Esteban-Rubio, Josefa Carrión-Navarro, Noemí García-Romero, Ricardo Prat-Acín, Carlos Fernández-Carballal, Cristobal Belda-Iniesta, Angel Ayuso-Sacido

1. Universidad San Pablo CEU, Madrid, Spain.  2. Fundación Hospital de Madrid-IMMA, Madrid, Spain.  3. IMDEA Nanoscience, Madrid, Spain.  4. Hospital Universitario la Fe, Valencia, Spain.  5. Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid, Spain.

a. susana.rubio91@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Keywords: GLUT4, DM2, ILK, striated muscle, insulin resistance, metabolic syndrome; Abstract

Abstract

BACKGROUND. Diffuse gliomas are the most common malignant primary tumors, and Glioblastoma (WHO grade IV) is the most frequent diffuse glioma with a median patient survival of 15 months after diagnosis. Temozolomide (TMZ) and radiotherapy is currently the first-line of treatment for this disease, however, survival remains poor among these patients because of resistance to TMZ. The identification and validation of biomarkers for prosgnostic and responsed to therapy values, using minimally invasive approaches, along the course of the disease, will significalntly improve the management of these tumors. In this sense, the use of liquid biopsies would allow to for the monitoring of tumor changes in real time. Thereby, glioma cell extracellular vesicles (EVs) containing mRNA, gDNA or proteins, can cross the Blood Brain Barrier reaching the peripheral blood, from where they can be isolated and their cargo analysed. Somatic mutations at codon 132 of the isocitrate dehydrogenase 1 gene (IDH1) have been identified in approximately 12% of glioblastomas. This subgroup of patients display better prognostic, with improved overall survival. Our group have recently detected IDH1 gDNA sequences within EVs isolated from either tumor cells or EVs isolated from peripheral blood of athymic mice xenografted with cancer-initiating cells. RESULTS AND CONCLUSION. We have studied the IDH1 sequence of EVs-isolated gDNA of peripheral blood samples from patients diagnosed with different degree of gliomas, together with controls. The results were validated by analysing the IDH1 sequence within the counterpart paraffin-embedded solid tumor specimens. Here we show a proof of concept for the use of the IDH1 mutations within peripheral blood EVs, as a prognostic biomarker via a minimally invasive technique.

dianas 5(1) > Segovia-de-Andrés etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160362

Opposing roles of PIK3CA gene alterations to EZH2 signaling in Non-Muscle Invasive Bladder Cancer.

Cristina Segovia de Andrés, Mónica Martínez-Fernández, Marta Dueñas, Carolina Rubio, Fernando F López-Calderón, Clotilde Costa, Cristina Saiz-Ladera, María Fernández-Grajera, José Duarte, Jose L Rodriguez-Peralto, Federico de la Rosa, Felipe Villacampa, Daniel Castellano, Jesús M Paramio

1. Unidad de Oncología Molecular, CIEMAT. Avda Complutense 40, 28040 Madrid.  2. Grupo Oncología Molecular, Instituto de Investigación 12 de Octubre. Avda de Córdoba, s/n. 28041 Madrid.  3. Departamento de Urología, Hospital “12 de Octubre” Avda de Córdoba, s/n. 28041 Madrid.

a. cristina.segovia@ciemat.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Keywords: PI3K; EZH2; non-muscle invasive; bladder cancer

Abstract

Bladder cancer (BC) is a current challenging problem in the clinics. At diagnose, it can appear in two different pathological forms. The non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) represents 70% of BC cases and is treated by transurethral resection. However, they also show one of the highest rates of recurrence, which in some cases can progress into aggressive muscle-invasive tumors (MIBC). This requires a regular surveillance making NMIBC one of the most costly malignancies to health care systems in developed countries [1]. Moreover, there are not effective therapies for MIBC, besides cystectomy followed by conventional chemotherapy, which is still ineffective. Therefore is required the identification of biomarkers that may help to determine recurrence and possible progression in NMIBC. We previously demonstrated that PIK3CA gene alterations are extremely frequent in NMIBC, being present in non-affected bladder tissue, and predicted low recurrence and progression [2]. On the other hand, genomic profiling indicated that gene expression mediated by increased EZH2 expression, were associated with increased recurrence and progression [3]. The different clinical evolution of tumors characterized by either PIK3CA gene alterations, or increased expression and activity of EZH2, led us to hypothesize that these two pathways may exert opposite roles in NMIBC. Here, we report that molecular evidences using clinical samples and BC cell lines, that PI3K-dependent signaling negatively regulates EZH2-dependent processes. We demonstrate that PIK3CA alterations mediate increased expression of two miRNAs, miR-101 and miR-138, which post-transcriptionally downregulate EZH2 expression. In addition, the PIK3-dependent signaling activates Akt, which in turn phosphorylatesEZH2 on Ser21, which produces decreased H3K27 methyl transferase activity. These observations could help to define better clinical intervention protocols for NMIBC management.

1. Burger M, Oosterlinck W, Konety B, Chang S, Gudjonsson S, Pruthi R, et al. 2013. ICUD-EAU International Consultation on Bladder Cancer 2012: Non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder. European urology. 63:36-44.


2. Duenas M, Martinez-Fernandez M, Garcia-Escudero R, Villacampa F, Marques M, Saiz-Ladera C, et al. 2013. PIK3CA gene alterations in bladder cancer are frequent and associate with reduced recurrence in non-muscle invasive tumors. Mol Carcinog. 54:566-76.


3. Santos M, Martinez-Fernandez M, Duenas M, Garcia-Escudero R, Alfaya B, Villacampa F, et al. 2014. In vivo disruption of an Rb-E2F-Ezh2 signaling loop causes bladder cancer. Cancer Res. 74:6565-77.

dianas 5(1) > Arranz-Nicolás etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160361

Role of diacylglycerol kinase alpha (DGKα) in T cells tolerance regulation and tumor evasion.

Javier Arranz Nicolás, Antonia Ávila Flores, Isabel Mérida de San Román

Lipid Signaling Laboratory, Department of Immunology and Oncology, National Center of Biotechnology (CNB-CSIC).Darwin 3, 28049, Madrid.

a. jarranz@cnb.csic.es

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Abstract

Diacylglycerol kinase α is an enzyme highly expressed in mature T cells, where acts as a negative regulator by consuming Diacylglycerol (DAG). This DGKα role promotes hypofunctional immune response or anergy. DAG is generated in response to lymphocytes activation through their receptor (TCR), G protein-coupled receptors (GPCRs) or different kind of receptors. This molecule facilitates the activation of the Ras/ERK cascade. In tumors, the recruitment of immune cells with suppressive capacity and the characteristics of the tumor microenvironment (increased levels of adenosine, low oxygen and acidic pH) favor that T cells become anergic and that the activation of the TCR does not occur or occurs in a deficient manner. In this situation the transcription of certain genes, including DGKα gene, is promoted. In addition, tumors express high levels of DGKα, suggesting a positive role for this enzyme in these cells. Together these data indicate that DGKα could be relevant as a pharmaceutical target to block tumor growth and enhance T cell immunity. Based on this our main objective is the design and optimization of robust and reproducible trials in order to apply them for screening processes. To reach this objective we have developed and optimized sensors for DGKα activity through the Ras/ERK signaling axis that could be used as a control, both in normal activation and in presence of a positive compound working as an inhibitor of the enzyme. We will describe the optimization of different kind of assays including biochemical analysis, transcription reporter studies, imaging based assays and protein surface analysis by flow cytometry.

dianas 5(1) > González-Corpas etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160355

SHP-1 controla la expresión génica mediante la regulación de las modificaciones epigenéticas.

Ana González Corpas, María Jesús Orea Martínez, Begoña Colás, Santiago Ropero

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. agcorpas@gmail.com  b. oreamariajesus@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: cáncer de próstata; SHP-1; epigenética; HDAC2

Resumen

SHP1 es una fosfotirosina fosfatasa (PTP) que se expresa principalmente en células hematopoyéticas [1] aunque también se ha descrito su presencia en tejidos sólidos como la próstata. Aunque esta proteína tiene una localización fundamentalmente citosólica, nuestro grupo ha demostrado que en líneas celulares de cáncer de próstata también está presente en el núcleo [2], y que aquí podría controlar la expresión génica. Una de las funciones de las modificaciones epigenéticas es la regulación de la expresión génica. Las modificaciones epigenéticas mejor conocidas son la metilación del DNA y las modificaciones post-traduccionales de las histonas. En este trabajo nos propusimos determinar si SHP-1 regula la expresión génica mediante cambios en la metilación del DNA. Para ello, determinamos el estado de metilación de 1507 CpGs correspondientes a 807 genes en las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y PC3 en las que se anuló la expresión de SHP1 mediante siRNA. De estos ensayos seleccionamos un grupo de genes en los que la ausencia de SHP1 provoca una disminución de los niveles de metilación, concretamente GSTP1, RUNX1T1, NPY, HIN-1 y KIT. Dado que la metilación del DNA en la región promotora de los genes es una marca epigenética que se relaciona con la pérdida de expresión [3], a continuación se determinaron los niveles de mRNA de los genes seleccionados mediante qRT-PCR y observamos que la perdida de metilación se correlacionó con un aumento en la expresión. El tratamiento de las células LNCaP con el agente desmetilante 5-aza-2-deoxicitidina confirmó que los cambios en la expresión observados se deben a cambios en la metilación ya que produjo un aumento en la expresión de los genes seleccionados. Además, el tratamiento de las células LNCaP con SAHA, un inhibidor de histonas desacetilasas, provocó un aumento de la expresión de dichos genes. Todas las modificaciones epigenéticas cooperan en la regulación de la expresión, y en concreto la metilación del DNA va asociada con la pérdida de acetilación de las histonas en el promotor de los genes que no se expresan [4], por lo que a continuación determinamos el estado de acetilación de las histonas en los promotores de los genes seleccionados y observamos que el aumento en la expresión se correlaciona con una mayor acetilación de las histonas en la región promotora de estos genes. A la vista de estos resultados nos planteamos si SHP1 podría esta interaccionando con proteínas que regulan las modificaciones epigenéticas, especialmente, proteínas encargadas de mantener la metilación del DNA y el estado de acetilación de las histonas y de esta manera estar influyendo en la expresión génica. Para ello realizamos ensayos de “Pull Down” (PD) y observamos una interacción entre SHP1 y HDAC2, proteína encargada de la desacetilación de histonas [5]. Para comprobar si lo observado mediante PD se reproducía en un ensayo in vivo se realizarón ensayos de coinmunoprecipitación (IP) con los que se confirmó lo que ya habíamos observado mediante PD. En conclusión, nuestros datos indican que en líneas celulares de cáncer de próstata SHP1 podría regular la expresión de genes con importantes funciones en el mantenimiento de la homeostasis celular mediante el control de las modificaciones epigenéticas. Este efecto podría estar mediado por su interacción con HDAC2 que estaría provocando cambios en la acetilación de las histonas en el promotor de los genes seleccionados y por tanto sería el responsable de los cambios en la metilación observados.

1. C. Wu, M. Sun, L. Liu, and G. W. Zhou. The function of the protein tyrosine phosphatase SHP-1 in cancer. Gene, 306(1–2): 1–12, 2003.


2. P. López-Ruiz, J. Rodriguez-Ubreva, A. E. Cariaga, M. A. Cortes, and B. Colás. SHP-1 in cell-cycle regulation. Anticancer. Agents Med. Chem. 11(1):89–98, Jan. 2011.


3. J. Turek-Plewa, P. P. Jagodzinski. The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cell. Mol. Biol. Lett., 10(4):631–647, 2005.


4. T. Vaissière, C. Sawan, and Z. Herceg. Epigenetic interplay between histone modifications and DNA methylation in gene silencing. Mutat. Res. 659(1–2):40–8, 2008.


5. S. Ropero, M. Esteller. The role of histone deacetylases (HDACs) in human cancer. Mol Oncol 1:19–25, 2007.

dianas 5(1) > Orea-Martínez etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160354

Papel de la metilación del DNA en el desarrollo de resistencia del cáncer de próstata a los tratamientos hormonales.

María Jesús Orea Martínez, Ana González Corpas, Begoña Colas Escudero, Santiago Ropero Salinas

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. oreamariajesus@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: cáncer de próstata; receptor de andrógenos; modificaciones epigenéticas; metilación del DNA; bloqueo hormonal

Resumen

El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte entre los hombres en los países desarrollados. La mayoría de los tumores de próstata son dependientes de andrógenos en el momento del diagnóstico, de ahí que uno de los tratamientos clásicos sea el bloqueo hormonal mediante la ablación androgénica con agonistas de la hormona luteinizante (LHRH). Aunque prolonga la supervivencia, la respuesta a estos tratamientos es limitada y de forma casi invariable los pacientes desarrollan resistencia al bloqueo hormonal continuado [1,2]. Los cambios en las modificaciones epigenéticas juegan un papel decisivo en el desarrollo y progresión del cáncer así como en el desarrollo de la resistencia de los tumores a los tratamientos convencionales [3]. En este trabajo nos propusimos analizar el papel de la metilación del DNA en el desarrollo de resistencia de los tumores de próstata al bloqueo hormonal. Para ello hemos comparado el perfil de metilación de las células LNCaP, que expresan el receptor de andrógenos (RA) y responden a los tratamientos hormonales, y las LNCaP abl, que no responden al tratamiento hormonal pero siguen expresando el RA [4], mediante un array que permite determinar el estado de metilación de más de 450.000 CpGs distribuidas a lo largo de todo el genoma. De estos ensayos hemos seleccionado un grupo de genes siguiendo dos criterios: que presente diferencias de metilación y su funcionalidad celular. Atendiendo al primer criterio se han seleccionado dos grupos de genes, el primero que incluye los genes que se encuentran hipermetilados en las células LNCaP abl con respecto a las LNCaP (CLDN3, CEBPD, BSCL2 y MARCKS) y un segundo grupo donde los genes seleccionados (MPP1 y ESR1) se encuentran hipometilados en la línea LNCaP abl. En cuanto a su funcionalidad, estos genes intervienen en procesos tan importantes como son las uniones estrechas entre células (CLDN3) [5]; en la diferenciación celular (BSCL2) [6]; en la respuesta inmune e inflamatoria (CEBPD) [7]; en la regulación del citoesqueleto de actina (MARCKS) [8], en la proliferación celular (MPP1) [9] y en el desarrollo sexual (ESR1) [10]. En primer lugar se validaron los datos obtenidos en el array, mediante PCR específica de metilación (MSP), y secuenciación del DNA tratado con bisulfito de la región promotora de los genes seleccionados. Dado que la metilación del DNA en la región promotora de los genes es una marca epigenética que se relaciona con la pérdida de expresión [11], se determinaron los niveles de mRNA de los genes seleccionados mediante qRT-PCR y observamos que la expresión de los genes CLDN3, CEBPD, MARKS, BSCL2 disminuye en las células LNCaP abl en las que están metilados, mientras que la expresión de los genes hipometilados (MPP1 y ESR1) en esta línea aumentó con respecto a las células LNCaP. Por último, para confirmar que los cambios en la expresión observados en los genes seleccionados se deben a los cambios en la metilación del promotor, tratamos las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP abl y LNCaP con el agente desmetilante 5-aza-2-deoxicitidina. Este tratamiento produjo un aumento de la expresión de los genes CLDN3, CEBPD y MARKS en las células LNCaP abl y no la modificó en las células LNCaP. Lo contrario ocurrió con los genes que pierden metilación, el tratamiento solo aumentó su expresión en las células LNCaP. En conclusión, en este trabajo hemos identificado un grupo de genes cuya expresión está regulada por cambios en el estado de metilación de su región promotora en líneas celulares de cáncer de próstata que no responden a andrógenos y que, dada su función, podrían tener un papel relevante en el desarrollo de resistencia de los tumores de próstata a los tratamientos hormonales.

1. Dehm, SM; Tindall, DJ. 2007. Androgen receptor structural and functional elements: role and regulation in prostate cancer. Mol Endocrinol, 21:2855-2863


2. So, AI; Hurtado-Coll, A; Gleave, ME. 2003. Androgens and prostate cancer. World J Urol, 21:325-337.


3. Esteller, M. 2008. Epigenetics in Cancer. The New England Journal of Medicine 358: 1148-1159.


4. Culig, Z; Hoffmnn, J; Erdel, M; Eder, IE; Hobisch, A; Hittmair, A; Bartsch, G; Utermann, G; Schneider, MR; Parczyk, K; Klocker, H. 1999. Switch from antagonist to agonist of the androgen receptor blocker bicalutamide is associated with prostate tumour progression in a new model system. British Journal of Cancer: 81 (2), 242-251.


5. Morin J, Patrice. 2005. Claudin Proteins in Human Cancer: Promising New Targets for Diagnosis and Therapy. Cancer Res: 65, 9603-9606.


6. Chen, Weiquin. 2012. Berardinelli-Seip Congenital Lipodystrophy 2/Seipin Is Cell-Autonomous Regulator of Lipolysis Essential for Adipocyte Differentiation. Molecular and Cellular Biology; 1099-1111.


7. Balamurugan, Kuppusamy; Sterneck, Esta. 2013. The Many Faces of C/EBPδ and their Relevance for Inflammation and Cancer. International Journal of Biological Sciences; 9, 917-933.


8. Finlayson, AE; Freeman, KW. 2009. A Cell Motility Screen Reveals Role for MARCKS-Related Protein in Adherens Junction Formation and Tumorigenesis. PLoS ONE 4(11): e7833. doi:10.1371/journal.pone.0007833.


9. Seo, Pil-Soo. 2009. Identification of Erythrocyte p55/MPP1 as a Binding Partner of NF2 Tumor Suppressor Protein/Merlin. Experimental Biology and Medicine. 234 (3): 255- 621.


10. J. Bastian, Patrick. 2008. CpG Island Hypermethylation Profile in the Serum of Men With Clinically Localized and Hormone Refractory Metastatic Prostate Cancer. J Urol. 179 (2): 529-535.


11. Turek-Plewa, J; Jagodzinski, PP. 2005. The role of Mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cellular & Molecular biology letters 10: 631-647.

dianas 5(1) > Zarka-Trigo y Roldan

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160353

Señalización celular post-eyaculación de los espermatozoides de mamíferos.

Daniel Zarka Trigo, Eduardo Roldan

Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC. Calle de José Gutiérrez Abascal, 2, 28006 Madrid.

a. dr.zarkajr@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: capacitación; fertilización; espermatozoides; señalización celular REDOX; ROS; espermatología

Resumen

Los espermatozoides son un tipo celular muy excepcional en el campo de la señalización celular, debido a que son células germinales y poseen el núcleo haploide, muy compactado y aparentemente inactivo. A diferencia de en otras especies animales, las hembras de mamíferos no disponen de una espermateca que mantenga a los espermatozoides con vida hasta el momento de la fertilización. Por ello, y para evitar la muerte celular prematura, los espermatozoides de mamíferos se almacenan en el epidídimo sin estar completamente maduros. Por lo tanto estos espermatozoides requieren de una fase de maduración post-eyaculado para desarrollar su potencial fertilizador [1, 2]. A este proceso se le denomina capacitación, e incluye una serie de cambios metabólicos, fisiológicos y funcionales fuertemente regulados por diversas vías de señalización [1, 3-5]. Entre los cambios fisiológicos más notables se encuentran la reorganización de la membrana plasmática, que otorga al espermatozoide la capacidad de reconocer al ovocito y fusionarse con él [5, 6], cambios en el patrón de natación (hiperactivación) del espermatozoide [7, 8] y la preparación del espermatozoide para la reacción acrosómica, previa a la fusión del mismo con el óvulo [9, 10]. El estudio de la señalización celular de la capacitación está en auge, y varios grupos de investigación están demostrando las complejas vías de señalización de este importante proceso. Se ha determinado que la capacitación requiere inicialmente la pérdida de diversas moléculas de la superficie espermática, como son el colesterol, determinadas proteínas y de otras moléculas (Zn, Sg), permitiendo con ello la reorganización de la membrana plasmática y la aparición de proteínas transmembrana que intervienen en la señalización celular [6, 11, 12]. En segundo lugar se da la aparición de AMPc por medio de la activación de la adenilato ciclasa y por ello, la activación de proteínas kinasas (PKA y PKC) [1, 12-16]. La activación de proteínas kinasas es responsable de la posterior activación de diversas cascadas de señalización como las MAP-Kinasas, AKAPs, Pi3K/Akt, ERK, Ras/Raf, etc [17, 18]. Las publicaciones más recientes sugieren la participación de las especies reactivas derivadas del oxígeno (ROS) y derivadas del nitrógeno (NOS), como segundos mensajeros de la señalización celular de la capacitación [3, 17-20]. También se indica que el parecido de la vía de señalización de la capacitación con las vías de la señalización propias de la apoptosis de células somáticas, define una estrategia en la que la programación celular típica de los espermatozoides fuera principalmente su muerte, salvo que el encuentro con ciertas señales del aparato reproductor femenino conduzca a la adquisición de su potencial fertilizador y la fecundación del óvulo [21].

1. P. E. Visconti, J. L. Bailey, G. D. Moore, D. Pan, P. Olds-Clarke, and G. S. Kopf. 1995 Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation., Development 121(4):1129–37.


2. H. Pons-Rejraji, J. L. Bailey, and P. Leclerc. 2009 Modulation of bovine sperm signalling pathways: correlation between intracellular parameters and sperm capacitation and acrosome exocytosis. Reprod. Fertil. Dev. 21(4):511–24.


3. S. S. Du Plessis, A. Agarwal, J. Halabi, and E. Tvrda. 2015 Contemporary evidence on the physiological role of reactive oxygen species in human sperm function. J. Assist. Reprod. Genet. 32(4):509–20


4. L. R. Fraser, S. Adeoya-Osiguwa, R. W. Baxendale, S. Mededovic, and O. O. Osiguwa. 2005. First messenger regulation of mammalian sperm function via adenylyl cyclase/cAMP. J. Reprod. Dev. 51(1):37–46.


5. a Boerke, P. S. Tsai, N. Garcia-Gil, I. a Brewis, and B. M. Gadella. 2008. Capacitation-dependent reorganization of microdomains in the apical sperm head plasma membrane: functional relationship with zona binding and the zona-induced acrosome reaction. Theriogenology 70 (8):1188–96.


6. C. E. Au, L. Hermo, E. Byrne, J. Smirle, A. Fazel, R. E. Kearney, C. E. Smith, H. Vali, J. Fernandez-Rodriguez, P. H. G. Simon, C. Mandato, T. Nilsson, and J. J. M. Bergeron. 2015. Compartmentalization of membrane trafficking, glucose transport, glycolysis, actin, tubulin and the proteasome in the cytoplasmic droplet/Hermes body of epididymal sperm., Open Biol. 5(8).


7. V. J. Kay and L. Robertson. 1998. Hyperactivated motility of human spermatozoa: a review of physiological function and application in assisted reproduction., Hum. Reprod. Update 4(6) :776–86.


8. H. Ho and S. S. Suarez. 2001 Hyperactivation of mammalian spermatozoa?: function and regulation, Vol 122 (4):519–526.


9. H. Breitbart and B. Spungin. 1997. The biochemistry of the acrosome reaction., Mol. Hum. Reprod. 3(3):195–202.


10. E. De Lamirande, P. Leclerc, C. Gagnon, and E. de Lamirande. 1997. Capacitation as a regulatory event that primes spermatozoa for the acrosome reaction and fertilization., Mol. Hum. Reprod. 3(3):175–94.


11. N. L. Cross. 1998. Role of cholesterol in sperm capacitation., Biol. Reprod. 59(1):7–11.


12. J. E. Osheroff, P. E. Visconti, J. P. Valenzuela, A. J. Travis, J. Alvarez, and G. S. Kopf. 1999. Regulation of human sperm capacitation by a cholesterol efflux-stimulated signal transduction pathway leading to protein kinase A-mediated up-regulation of protein tyrosine phosphorylation. Mol. Hum. Reprod. 5 (11):1017–26.


13. F. Urner, G. Leppens-Luisier, and D. Sakkas. 2001. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose., Biol. Reprod. 64(5),:1350–1357.


14. B. Marquez and S. S. Suarez. 2004. Different signaling pathways in bovine sperm regulate capacitation and hyperactivation., Biol. Reprod. 70(6):1626–33.


15. H. Breitbart and Z. Naor. 1999. Protein kinases in mammalian sperm capacitation and the acrosome reaction., Rev. Reprod. 4(3):151–9.


16. R. K. Naz and P. B. Rajesh. 2004. Role of tyrosine phosphorylation in sperm capacitation / acrosome reaction., Reprod. Biol. Endocrinol. 2 (1) p. 75.


17. C. O’Flaherty. 2015. Redox regulation of mammalian sperm capacitation., Asian J. Androl. 17(4):583–90.


18. O. Flaherty, E. De Lamirande, and C. Gagnon. 2006. Reactive oxygen species modulate independent protein phosphorylation pathways during human sperm capacitation. Free Radic Biol Med. 40 (6):1045–1055, 2006.


19. H. D. Guthrie and G. R. Welch. 2012. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology 78(8):1700–8.


20. J. Fujii and S. Tsunoda. 2011. Redox regulation of fertilisation and the spermatogenic process., Asian J. Androl. 13(3):420–3.


21. R. J. Aitken, M. A. Baker, and B. Nixon. 2015. Are sperm capacitation and apoptosis the opposite ends of a continuum driven by oxidative stress?, Asian J. Androl. 17(4):633–9.

dianas 5(1) > Sosa-Callejas etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160352

Papel de la hiperfosfatemia en la sarcopenia: Homeostasis proteica y senescencia.

Patricia Sosa Callejas, Nuria Troyano, Inés Mora, Diana Medrano, Patricia Plaza, Mercedes Griera, Marco Hatem, Gemma Olmos, Susana López, María Piedad Ruiz-Torres

1. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud. Universidad de Alcalá and Unidad de investigación.  2. RedinRen, Instituto de Salud Carlos III. Madrid. Spain.  3. Fundación para la Investigación Biomédica, Hospital Príncipe de Asturias. Alcalá de Henares.

a. patricia.sosacalle@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: Sarcopenia; senescencia; hiperfosfatemia; mioblasto; enfermedad renal crónica

Resumen

INTRODUCCIÓN. Se ha descrito un aumento en la concentración sérica de fosfato en la enfermedad renal crónica y en el envejecimiento. Una patología asociada en ambos casos es la sarcopenia, caracterizada por la pérdida de masa y fuerza muscular, que puede ser debida, en parte, a la pérdida de la capacidad regenerativa en el músculo. El objetivo del trabajo fue estudiar si la hiperfosfatemia induce la pérdida de la capacidad regenerativa muscular debido al aumento de la senescencia de los mioblastos y los mecanismos implicados en este fenómeno. MATERIALES Y MÉTODOS. Se utilizaron mioblastos C2C12 de ratón en cultivo. Las células fueron tratadas con 10 mM de β-glicerofosfato (BGP) durante 24, 48 o 72 horas como donador de fósforo extracelular. Se analizó la expresión de genes de senescencia como p16, p21 y p53 mediante western blot. El porcentaje de células senescentes identificado por la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia, fue analizado por microscopia confocal utilizando el substrato, 5-dodecanoylaminofluoresceina di-beta-D-galactopyranosido. Para demostrar una relación directa entre hiperfosfatemia y senescencia se utilizó ácido fosfonofórmico, inhibidor del transportador Na-Pi. Se estudió el efecto del BGP sobre los distintos sistemas de degradación proteica, midiendo la actividad del proteosoma, mediante el uso de un sustrato fluorogénico específico, y la autofagia, analizando los niveles de expresión de p62 y LC3I respecto a LC3II, mediante western blot. La actividad total de calpainas, mediante el uso de un sustrato fluorogénico específico y la expresión de calpainas 1, 2 y 3 analizada por western blot. Para establecer si el efecto sobre los sistemas de degradación proteica fue responsable de la senescencia inducida por BGP se midió está en presencia de 1uM calpeptina, inhibidor de calpainas, y 50nM de rapamicina, activador de la autofagia. RESULTADOS. BGP incrementó la expresión de p53, así como el porcentaje de células senescentes. El uso del ácido fosfonofórmico suprimió este incremento durante el tratamiento con BGP, lo que indica que la senescencia fue dependiente del aumento de BGP. Se observó que el BGP induce una disminución de la actividad del proteosoma y un aumento de p62 y LC3I/LC3II, lo que se corresponde con una disminución de la autofagia. Respecto a la actividad total y la expresión de calpainas 1, 2 y 3 el BGP induce un incremento en ambos valores. La adición de calpeptina inhibió el aumento en p53, lo que indica que la vía de las calpainas está relacionada con el efecto senescente del BGP. Cuando se procedió a la activación de la autofagia con rapamicina se comprobó que no se producían los aumentos de genes senescentes con BGP, indicando que la autofagia jugó un papel central en la inducción de la senescencia. CONCLUSIÓN. El aumento en la concentración de fósforo extracelular induce senescencia en los mioblastos de musculo esquelético, estas células muestran un incremento en la actividad de calpaina y una disminución de la actividad proteolítica del proteosoma y la autofagia. Esta alteración en la homeostasis de proteínas está implicada en la inducción de senescencia en los mioblastos y este podría ser un mecanismo involucrado en la progresión de la sarcopenia ligada a envejecimiento o enfermedad renal crónica.

1. N. Troyano et al. Hyperphosphatemia induces cellular senescence in human aorta smooth muscle cells through integrin linked kinase (ILK) up-regulation. Mechanisms of Ageing and Development, 2015


2. S. Burattini et al. C2C12 murine myoblast as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry, 2004.


3. Nasser Al-Shantia et al. Activated Lymphocytes Secretome Inhibits Differentiation and Induces Proliferation of C2C12 Myoblasts. Cell Physiol Biochem 2014; 33:117-128

dianas 5(1) > de-la-Usada-Molinero etal

dianas | Vol 5 Num 1 | marzo 2016 | e20160351

NONADICTINA, un tratamiento teórico para la adicción.

Eduardo de la Usada Molinero, Fernando Fernández García, Laura Martín Díaz, Javier Merino Valverde, Lorena Torres Valle

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. edu231288@gmail.com

I Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2016
Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá (UAH). Alcalá de Henares, Madrid (Spain)

Palabras clave: ΔFosB; adicción; cocaína; siRNA; liposomas

Resumen

España lidera el ranking mundial en consumo de cocaína según el Observatorio Europeo de las Drogas y las Toxicomanías. El consumo crónico de esta sustancia conlleva unos efectos que derivan en una adicción que impide al enfermo llevar una vida normal, pues se imponen unas pautas comportamentales a través de la vía de recompensa cerebral que le dirigen a la búsqueda compulsiva de la droga. Por esta razón es más importante encontrar un tratamiento que ayude al paciente a superar esta situación que uno que palíe los síntomas del síndrome de abstinencia. La cocaína bloquea la recaptación de dopamina a nivel de la sinapsis entre la neurona presináptica dopaminérgica del área tegmental ventral y la neurona postsináptica del núcleo accumbens, aumentando la estimulación por dopamina en éste último, el cual está relacionado con fenómenos de recompensa. La dopamina se une a sus receptores de tipo D1, produciendo la activación o la represión transcripcional de distintos genes, donde juega un papel primordial el factor transcripcional ΔFosB, y la activación de la vía de las MAPK [1]. A largo plazo, la acumulación patológica de ΔFosB conduce a una expansión de dendritas neuronales y a una disminución en la expresión de dinorfina, opioide endógeno implicado en la regulación negativa de la estimulación dopaminérgica. Distintos autores relacionan estos hechos con un aumento de los mecanismos de recompensa que conducen finalmente a la adicción [2]. En este trabajo proponemos un hipotético tratamiento para la adicción a la cocaína basado en el conocimiento de las vías de señalización que desencadenan su consumo crónico. De las posibles dianas terapéuticas implicadas en la adicción, consideramos potencialmente útiles: los receptores de tipo D1, para los cuales se haría un análogo de la droga; y ΔFosB, variante de splicing de FosB que se acumula debido a su elevada estabilidad. Decidimos actuar sobre ΔFosB porque su acumulación parece ser la responsable directa de la adicción. FosB solo se diferencia de ΔFosB en que éste carece de los 101 aminoácidos del extremo C-terminal [3]; por lo que en vez de orientar nuestra terapia contra la proteína, lo cual sería poco específico, la dirigimos contra el RNA mensajero que codifica para ΔFosB. Diseñamos un siRNA específico de ΔFosB aprovechando las características diferenciales de su secuencia. Para ejercer su efecto sería necesario que atravesara la barrera hematoencefálica, para lo cual proponemos el empleo de liposomas catiónicos pues ya han demostrado su eficacia previamente [4]. Para probar la eficacia del tratamiento planteamos estudios in vitro e in vivo. Cabría esperar una disminución de ΔFosB a niveles basales con el tiempo, ya que el siRNA inhibe la síntesis de nuevo ΔFosB pero no actúa sobre el ya formado. El tratamiento daría lugar a una neuroadaptación que ayudaría a acelerar la recuperación en la rehabilitación y sería eficaz frente a recaídas. Dado que ΔFosB solo se encuentra alterado en patologías, su inhibición no debería tener efectos adversos, aunque no debemos descartar posibles efectos inespecíficos debidos al propio siRNA o a la formulación. Sería interesante administrar una terapia combinada a los pacientes, suplementando el tratamiento de siRNA con otros fármacos como agonistas los receptores de tipo D1 de dopamina y/o antidepresivos [5]. Por último, cabe destacar que el tratamiento propuesto podría ser eficaz para otras adicciones, pues todas convergen en la vía de recompensa y tienen en común la acumulación de ΔFosB.

1. Ron D, Jurd R. 2005. The ‘ups and downs’ of signaling cascades in addiction. Sci STKE. 2005(309):re14


2. Nestler EJ. 2013. ΔFosB: a Molecular Switch for Reward. J Drug and Alcohol Research. 2(2013):art235651.


3. Ruffle JK. 2014. Molecular neurobiology of addiction: what’s all the (D)FosB about? Am J Drug Alcohol Abuse. 40(6):428-437


4. Pulford B, Reim N, Bell A, Veatch J, Forster G, et al. 2010. Liposome-siRNA-Peptide Complexes Cross the Blood-Brain Barrier and Significantly Decrease PrPC on Neuronal Cells and PrPRES in Infected Cell Cultures. PLoS ONE. 5(6):e11085.


5. Quednow BB, Herdener M. 2015. Human pharmacology for addiction medicine: From evidence to clinical recommendations. Prog Brain Res. 224:227-50