dianas 7(1) > Matamoros-Recio etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803p12

Heteroaromatic azonia cations with application as DNA fluorescent probes.

Alejandra Matamoros Recio^a, Pedro Bosch, David Sucunza, Francisco Mendicuti, Juan José Vaquero, Alberto Domingo

Universidad de Alcalá.

a. alejandra-m-r@hotmail.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión de paneles

Resumen

The fluorimetric detection and visualization of biomacromolecules is a key technique in bioanalytical chemistry. Fluorescent probes whose emission intensity increases upon association with biomacromolecules such as DNA or proteins (“light-up probes”) are useful markers in genomics and proteomics. These probes can be used to stain subcellular structures in fluorescence microscopy, flow citometry and cell sorting, or to stain nucleic acids and proteins in gel electrophoresis. Condensed polyaromatic azonia cations are a family with good fluorescent and DNA intercalating properties. However, the fluorescence intensity of most of these tested cations is efficiently quenched upon complexation with DNA. Herein, we report a small library of azonia cations based on benzimidazolium core. Some of them have shown a significantly fluorescence increase upon DNA addition and promising properties as live-cell fluorescent stains in confocal microscopy of live HeLa cells.

dianas 7(1) > Elvira-Blázquez y Díaz-Gago

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803p11

Screening de inhibidores de NFATc1 para el tratamiento de la osteoporosis.

Daniel Elvira Blázquez, Sergio Díaz Gago

Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina, UAH.

a. daniel.elvira@edu.uah.es  b. sergio.diazgago@edu.uah.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión de paneles

Resumen

La osteoporosis es una enfermedad caracterizada por el aumento de la fragilidad esquelética debido a una disminución de la masa y calidad ósea, que se debe a un desequilibrio en el balance entre osteoblastos/osteoclastos y que afecta fundamentalmente a cadera, espina vertebral y muñeca. Uno de los motivos de dicho desequilibrio se debe a una mayor diferenciación de monocitos a osteoclastos, proceso regulado por los osteoblastos a través del M-CSF y RANKL. RANKL, se expresa en la membrana de los osteoblastos, y al unirse a su receptor en las células precursoras de osteoblastos, provoca la activación de las vías de señalización de las MAPK de ERK y JNK, de la vía de NF-kB y de la vía de la PLC-calcineurina. Estas vías aumentan la expresión y actividad del factor de transcripción NFATc1, el cual una vez en el núcleo, regula la expresión de proteínas intervienen en la diferenciación y fisiología del osteoclasto. Debido al papel fundamental de NFATc1 en la diferenciación de los osteoclastos, nuestro objetivo es la búsqueda de nuevos inhibidores de NFATc1, en concreto nos centramos en moléculas que inhiban la interacción de NFATc1 con su activador, la calcineurina, que se encarga de defosforilar y por tanto permite su translocación al núcleo. En base a esto y las estructuras de ambas proteínas, diseñamos un HTS que permite encontrar moléculas que inhiban dicha interacción. NFATc1 interacciona con Calcineurina a través de la secuencia consenso de NFATc1, DQYLAVP, y la Calcineuina a través de 4 aminoácidos que interaccionan con dicha secuencia consenso. Las moléculas que diseñamos para inhibir dicha interacción se basan en mimetizar los 4 aminoácidos de la Calcineurina. Para realizar el “screening” de los compuestos miméticos, se realizaron 3 construcciones distintas, una para la subunidad A de la Calcineurina, otra de la subunidad B de la Calcineurina y una tercera para NFATc1. El resultado de estos clonajes serán la Calcineurina con la etiqueta molecular CFP en la subunidad A y NFATc1 con YFP, las cuales empleamos para realizar el primer cribado “in vitro” mediante la técnica del FRET. Aquellos inhibidores que impidieron la interacción entre NFATc1 y Calcineurina, pasaron a un segundo cribado “in vivo” en el que incubamos células osteoclásticas con los inhibidores, y tras su lisado, realizamos un ensayo ELISA para detectar los niveles de p-NFATc1. Finalmente, probamos la toxicidad de los inhibidores empleando células HepG2.

dianas 7(1) > Recio-Aldavero etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803p10

Optimización del método de aislamiento de exosomas en orina.

Jorge Recio Aldavero, Ángeles Sanchís Bonet, Marta Barrionuevo González, Ana María Bajo Chueca

a. jorge.recio@hotmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión de paneles

dianas 7(1) > Herraiz-López etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803p01

Exosomas en sangre como biomarcadores diagnóstico y pronóstico en el cáncer de próstata.

María Herraiz López, Ana María Bajo Chueca, Ángeles Sanchís Bonet

1. Hospital Universitario Príncipe de Asturias. Carretera Alcalá-Meco S/N, Alcalá de Henares, Madrid. España.  2. Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. maria.herraiz.lopez@gmail.com  b. ana.bajo@uah.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión de paneles

Palabras clave: exosomas; cáncer de próstata; diagnóstico; pronóstico; biomarcadores

Resumen

El cáncer de próstata (CP) es la neoplasia primaria más frecuente en nuestro entorno, con una mortalidad del 18%. Como biomarcadores séricos para su diagnóstico y pronóstico, se utilizan el antígeno prostático específico (PSA) y sus derivados (densidad de PSA, fracción libre de PSA y [-2]proPSA), además de la calicreína humana 2. Desde el punto de vista diagnóstico, el PSA es muy sensible pero poco específico y además en la enfermedad hormonorefractaria no resulta útil para su seguimiento. Recientemente, marcadores genómicos (como el PCA3) han mostrado su utilidad discriminando a varones con alto riesgo de desarrollar CP y cánceres agresivos, por lo que podrían ser una fuente de dianas terapéuticas en un futuro. En este contexto, los estudios sobre exosomas están arrojando resultados muy prometedores, aunque no existe una validación de los mismos desde el punto de vista diagnóstico y pronóstico. Esta revisión pretende demostrar la utilidad de los exosomas en sangre en el diagnóstico y pronóstico del CP. Los exosomas son nanovesículas liberadas por todos los tipos celulares que intervienen en la comunicación intercelular, pero también están implicados en el desarrollo y progresión del cáncer. Contienen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y metabolitos, que portan información y material genético de las células que los secretan. Se caracterizan por la presencia de proteínas específicas: tetraspaninas, proteínas transportadoras (ESCRT), anexinas, proteínas de choque térmico, integrinas y GTPasas de la familia RAB. Los exosomas secretados por la próstata (prostatosomas) pueden aislarse en semen, tejido, sangre y orina. Existen varios métodos de extracción y purificación: centrifugación secuencial y ultracentrifugación, filtración, aislamiento basado en inmunoafinidad y técnicas de microfluídos. Los prostatosomas se obtienen del plasma de pacientes con CP (centrifugación de la sangre extraída por venopunción), mediante ultracentrifugación o utilizando conjugados con anticuerpos anti-CD9 y anti-antígeno de membrana próstata específico (PSMA). Como los prostatosomas son únicos en tamaño, composición lipídica y contenido proteico, pueden identificarse por Western blotting, cuantificación proteica o microscopía electrónica de transmisión; así como detectando marcadores prostáticos (PSMA y receptor androgénico). El reto es encontrar biomarcadores específicos en la superficie de prostatosomas de células cancerosas que permitan aislarlos del resto de exosomas en líquidos biológicos, aumentando su utilidad clínica. Los exosomas están implicados en el crecimiento y progresión tumoral, angiogénesis, preparación de nichos pre-metastásicos y resistencia al tratamiento. La concentración de exosomas séricos es mayor en pacientes con cáncer. En hipoxia (relacionada con mal pronóstico, fracaso de tratamiento y recaídas), se secretan más prostatosomas y contienen más triglicéridos y proteínas que promueven la transición epitelio-mesenquimal, invasividad e indiferenciación celular, y aumentan la expresión de actina en fibroblastos de próstata normales, dando lugar a un fenotipo de fibroblasto asociado a cáncer. Los exosomas séricos revelan información de las células que los secretan, usándose como “biopsia líquida” para identificar nuevos marcadores en el diagnóstico temprano, pronóstico y búsqueda de nuevas terapias frente al cáncer. Por tanto, los análisis de exosomas ofrecen una oportunidad única para desarrollar nuevos biomarcadores de proteínas y/o ácidos nucleicos para detectar y monitorizar CP, especialmente en el CP metastásico y hormono-refractario.

dianas 7(1) > Antón-Cornejo etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803p02

Exosomas en orina como biomarcadores diagnóstico y pronóstico en el cáncer de próstata.

Alba Antón Cornejo, Ana María Bajo Chueca, Ángeles Sanchís Bonet

1. Hospital Universitario Príncipe de Asturias. Carretera Alcalá-Meco S/N, Alcalá de Henares.  2. Departamento de Biología de Sistemas. Univerisdad de Alcalá.

a. albaantcor@gmail.com  b. ana.bajo@uah.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión de paneles

Palabras clave: exosomas, cáncer de próstata, biomarcadores, PSMA, diagnóstico, pronóstico.

Resumen

El cáncer de próstata (CaP) es un problema global de salud. Atendiendo a la base de datos de GLOBOCAN el CaP es el segundo tipo de cáncer más frecuente en varones (15%). El descubrimiento del antígeno prostático específico (PSA) supuso un cambio en la forma de diagnosticar y tratar la enfermedad, siendo la herramienta más usada en el cribado y monitorización de la enfermedad. Sin embargo, los beneficios en términos de supervivencia cáncer-específica asociados al cribado con PSA son contradictorios. Los avances alcanzados con las nuevas terapias ponen de manifiesto más aún la necesidad de encontrar biomarcadores que puedan predecir mejor la respuesta a las nuevas terapias y, por tanto, una mejor selección de los pacientes para dichas terapias. La identificación de biomarcadores contenidos en plasma y orina (biopsia líquida) representaría una técnica no invasiva de diagnóstico y pronóstico, siendo de particular importancia puesto que pueden obtenerse en cualquier momento a lo largo del curso de la enfermedad y podrían reflejar mejor la heterogeneidad en el comportamiento del tumor frente a los hallazgos de una biopsia aislada de próstata. Los rápidos avances en las técnicas genómicas y proteómicas han hecho posible identificar un gran número de biomoléculas que portan unos de los marcadores más prometedores, los exosomas. Éstos son pequeñas vesículas de membrana de 30-100 nm contienen proteínas (CD63, LAMP-2, CD9), ADN, genes de fusión, ARNm, microARN (miARN), otros RNA no codificantes y diversos lípidos. En este sentido, el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) es una glicoproteína de membrana celular liberada desde los exosomas, y es por tanto un marcador de la expresión de los mismos en distintos tejidos y en distintos fluidos, como plasma y orina. Una gran variedad de tipos celulares liberan exosomas; entre ellos, eritrocitos, linfocitos, plaquetas, células dendríticas y tumorales. Cuando los exosomas liberan su contenido al espacio extracelular participan como transmisores de señales de comunicación entre células, transfiriendo componentes biológicamente activos. Además, se ha descrito que las células de cáncer de próstata producen un mayor número de exosomas con un contenido diferencial, siendo aún más relevante esta sobreexpresión en células hormono-refractarias y metastásicas. Como la expresión de los exosomas puede modificarse tras tratamiento hormonal, una de las ventajas que pueden ofrecer estos biomarcadores exosomales frente al PSA es su independencia del receptor androgénico, por lo que su expresión no se ve afectada y puede aislarse antes, durante y después del tratamiento. La permeabilidad linfática y sanguínea de los exosomas procedentes de células tumorales, la estimulación de la angiogénesis, el favorecimiento de la migración, el crecimiento de nichos metastásicos, la proliferación celular tumoral y la generación de resistencias a fármacos, son propiedades responsables de la progresión del cáncer. Un biomarcador ideal es áquel que posea una elevada especificidad y sensibilidad en el diagnóstico y pronóstico de enfermedad, con la menor invasividad. El objetivo de este trabajo es presentar una revisión actualizada del papel que tienen los exosomas que se pueden aislar en la orina (prostatosomas) de los varones con CaP. Para ello expondremos la literatura más actualizada en las técnicas que permiten aislarlos (ultracentrifugación secuencial, la ultrafiltación y el uso de anticuerpos conjugados anti-CD9), identificarlos (ensayos de cuantificación proteica, Western blot y microscopía electrónica de transmisión, así como también la determinación de PSMA.