dianas 8(1) > Bernal etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903b34

Hipersensibilidad dental: estudios experimentales en ratón.

Laura Bernal^a, Pamela Sotelo-Hitschfeld, Carolina Roza, Katharina Zimmermann

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. 28871, Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. laura.bernal@uah.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B3, Mixta.

Palabras clave: aferencia dental; hipersensibilidad dental; frío; mentol

Resumen

El dolor dental, especialmente la hipersensibilidad dental, es un problema clínico y social con alta prevalencia. Su fisiopatología se desconoce y no hay tratamiento para los pacientes, que se quejan de dolor en respuesta a la estimulación con frío. En el sistema nervioso somático se han identificado diferentes canales de potencial receptor transitorio (TRP) como transductores de frío (Julius D. 2013). Estos canales también están presentes ganglios trigeminales humanos y de roedores (Hermanstyne TO et al. 2008), lo que sugiere que podrían tener un papel en la transducción de frío en aferencias primarias dentales (APD). Adaptamos la preparación mandíbula-nervio para realizar registros electrofisiológicos de APD en ratón. La actividad eléctrica de las fibras sensoriales se registró mediante microelectrodos de succión, y se aplicaron estímulos de frío. En algunas fibras sensibles al frío, se aplicó mentol (100 µM). Además, los cuerpos celulares de las neuronas APD se identificaron mediante marcaje retrógrado, basándose en la aplicación DiI en una cavidad perforada en los molares. Tras 5 días, se extrajeron los ganglios trigéminos y se realizó cultivo primario. Las células se cargaron con Fura2AM y se sometieron a mediciones ratiométricas de calcio. Registros electrofisiológicos en dientes intactos de ratón C57BL/6J mostraron una incidencia del 3% de fibras sensibles al frío (n = 2/68), la cual aumentó hasta el 10% (29/300) tras exponer la pulpa dental. Registros en ratones TRPM8-/- mostraron una reducción del número de fibras sensibles al frío a ~6% (5/81), sin diferencias en ninguno de los parámetros analizados. La perfusión de mentol en ratones wildtype (17/31), provocó en dos casos una respuesta excitadora; su combinación con frío potencio la respuesta en 4 fibras. En conjunto, el 35% (6/17) de las fibras sensibles al frío se definieron como mentol-sensitivas. De modo similar, los experimentos de imagen de calcio identificaron el 13% de las APD marcadas en ratones C57BL/6J eran sensibles al frío (11/86), respondieron el 70% de ellas a la aplicación de mentol 500 μM (a 25 ºC). Estos resultados indican que TRPM8 mantiene un papel en la transducción en frío en el diente, pero no puede ser el único canal de transducción de frío. La combinación de una preparación ex vivo con estudios de sus cuerpos celulares permite investigar la especialización molecular de los nociceptores de pulpa dental tanto a nivel celular como de sistema sensorial intacto.

dianas 8(1) > Serna etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903b33

El Ácido Elágico protege de la pérdida de esfingolípidos asociados a la mielina en la Encefalomielitis Autoinmune Experimental.

Jorge Serna, Aránzazu Perianes-Cachero, Rocío Quintana-Portillo, David García-Seisdedos, Milagros Lerma, Eduardo Arilla-Ferreiro, Miguel A Lasunción, Óscar Pastor, Rebeca Busto

Servicio Bioquímica Clínica, H. U. Ramón y Cajal (Madrid).

a. jserna_87@hotmail.com

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B3, Mixta.

Palabras clave: Encefalomielitis autoinmune experimental; esclerosis múltiple; ácido elágico; polifenol; esfingolípidos; mielina

Resumen

Introducción: El modelo más común de la Esclerosis Múltiple, la Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE), está caracterizado por infiltración de células inflamatorias en el Sistema Nervioso Central y desmielinización. Anteriores estudios han demostrado que la administración de algunos polifenoles puede reducir las alteraciones neurológicas de la EAE. Objetivos: El propósito de este trabajo fue estudiar los efectos de la administración oral de ácido elágico, un polifenol común, en ratas a las que se le indujo EAE. Métodos: La EAE fue inducida en ratas Lewis por inyección de tejido de médula espinal de cobaya junto con adyuvante completo de Freund que contenía Mycobacterium tuberculosis. El ácido elágico fue administrado en el agua de beber (10 mg/kg). Se realizó un análisis lipidómico mediante LC-MS/MS y MALDI-TOF/MS. La síntesis de ceramida fue realizada con 3H-palmitato y HPLC acoplado a un detector de radiación. Resultados: Los primeros signos clínicos aparecieron al 8º día después de la inmunización, coincidiendo con la reducción de Proteína Básica de Mielina (MBP) en el córtex. Los esfingolípidos, el otro componente principal de la mielina, también disminuyó en la fase aguda de la EAE, tanto en córtex cerebral como en médula espinal. En contraste, en las ratas que recibieron ácido elágico dos días antes de la inmunización, el comienzo de la enfermedad se retrasó y los signos clínicos se redujeron. Esta mejora de los signos clínicos fue acompañada de unos niveles mantenidos tanto de MBP como de clases de esfingolípidos en el córtex cerebral, por lo que sugiere un efecto neuroprotector de ácido elágico. Finalmente, demostramos que las urolitinas, el metabolito fisiológico del ácido elágico que circula en plasma, estimula la síntesis de ceramida en líneas celulares de glioma y oligodendroglioma. Conclusiones: Estos hallazgos indican que el consumo de ácido elágico tiene efectos neuroprotectores en ratas con EAE, probablemente mediante un mecanismo que involucra síntesis de esfingolípidos. Agradecimientos: Este trabajo fue apoyado por CIBEROBN, iniciativa ISCIII y SAF2015-70747-R (MINECO, ERDF).

dianas 8(1) > Arranz-Nicolás etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903b32

Diacylglycerol kinase alpha (DGKalpha) contribution to CD4+ T cell plasticity.

Javier Arranz-Nicolás, Denise Soutar, Antonia Ávila-Flores, Isabel Mérida

Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC). Calle Darwin, 3, Campus de Cantoblanco, 28049, Madrid, España.

a. jarranz@cnb.csic.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B3, Mixta.

Abstract

T lymphocytes rely on the generation of diacylglycerol (DAG) to commit to correct activation and differentiation. DAG is a lipid second messenger generated in response to T cell receptor (TCR) and costimulatory signals. It binds to proteins that encode Protein Kinase C (PKC) 1 (C1) conserved domains as RasGRP1 and PKC, facilitating their localization at the immune synapse and the activation of Ras/ERK (extracellular signal-regulated kinase) and PKC-derived cascades. These pathways lead to transcriptional activation of AP-1 (activator protein-1) and of NFB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), which in turn foster the expression of certain genes with response elements to these promoters, including the rapidly induced type II C-lectin membrane receptor CD69, as well as CD25, the late activation marker that confers high affinity for IL-2 in activated T cells. DAG abundance, and thus its signaling in T cells, is tempered by the and isoforms of the DAG kinase (DGK) enzyme family, which transform DAG into phosphatidic acid (PA) and limit DAG-regulated functions. In tumors, recruitment of immune cells with suppressive capacity and the particular characteristics of the tumor microenvironment promote T cell conversion to a hyporesponsive, anergic state in which the TCR is activated deficiently. Certain DGK isoforms, especially DGK, are highly expressed in tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and in tumors, suggesting a contribution of this enzyme to the mechanisms that regulate metastasis and immune evasion. DGK blockade might reinstate T cell attack on tumors and block tumor cell growth directly, making its targeting a promising strategy for coping with cancer. The intensity of TCR-triggered signals in the periphery modulate the equilibrium between effector and regulatory T cell populations by mechanisms that remain largely unresolved. Commitment to the T regulatory (Treg) cell lineage is regulated by AKT kinase and Forkhead box O (FoxO) family and requires the upregulation of the transcription factor Foxp3. It also has been described that blockade of ERK-derived signaling facilitates commitment to a Treg phenotype in detrimental of the effector T helper (Th) 17 cell population development, suggesting that ERK pathway promotes Th17 cell polarization and suppresses Treg cell differentiation. The development of different T cell subsets is regulated by a combination of the expression of a master transcriptional regulator and the phosphorylation of a particular STAT protein stimulated by distinct cytokines. IL-12 and IFN promote Th1 cells through activation of T-bet/STAT4. TGF and IL-2 stimulate Treg cell development through its activation of Foxp3/STAT5. Additionally, TGF drives Th17 cell differentiation in the presence of IL-6 through activation of RAR-related orphan receptor (ROR)t/STAT3. DGK limits Ras/ERK activation through negative regulation of RasGRP1. Previous studies in Prof. Dr. Mérida’s lab demonstrated that, in CD8+ T cells, DGK expression is transcriptionally repressed through the PI3K/AKT-mediated phosphorylation of FoxO in response to TCR and IL-2. These studies helped to link FoxO-dependent transcriptional regulation to the intensity of ERK-regulated signals in cytotoxic T cells. Our project now aims to investigate if the control of DGK expression in CD4+ T cells is important to regulate the plasticity of different populations in periphery. To this end, we are investigating the kinetics of DGK expression in ex vivo models of Th1, Treg and Th17 differentiation in mouse and human cells. At the same time and using DGK-deficient mice we pursue to demonstrate that polarization of naïve CD4+ T cells into effector/regulatory T cell populations is altered in the absence of this enzyme. Our final hypothesis aims to demonstrate that DGK expression in T cells is required to provide the plasticity necessary to differentiate into distinct lineages.

dianas 8(1) > Alcalde-Estévez etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903b31

Papel de las toxinas urémicas en la sarcopenia asociada a la enfermedad renal crónica.

Elena Alcalde-Estévez, Patricia Sosa, Ana Asenjo-Bueno, Patricia Plaza, Diego Rodríguez-Puyol, Manuel Rodríguez-Puyol, Gemma Olmos, Susana López-Ongil, María Piedad Ruiz-Torres

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. 28871, Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. elena_22_93@hotmail.com

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B3, Mixta.

Palabras clave: Toxinas urémicas; enfermedad renal crónica; sarcopenia; diferenciación miogénica y fibroadipogénica; proliferación; apoptosis

Resumen

INTRODUCCIÓN: Una condición asociada a la enfermedad renal crónica (ERC) es la pérdida de masa y fuerza muscular o sarcopenia. El músculo sarcopénico se caracteriza por una menor capacidad regenerativa. En el suero de los pacientes con ERC existe un factor que podría ser determinante en el desarrollo de sarcopenia, la uremia. El objetivo de este estudio es analizar el efecto de las toxinas urémicas sobre la proliferación de mioblastos así como sus procesos de diferenciación miogénica y fibroadipogénica. MATERIALES Y MÉTODOS: Para el análisis del proceso de diferenciación se emplearon mioblastos murinos C2C12 cultivados durante siete días con suero de caballo (2%), con el fin de promover la diferenciación miogénica, en presencia o ausencia de las toxinas urémicas indoxil sulfato y paracresol a concentraciones correspondientes con estadios iniciales de la ERC (25mg/ml y 10mg/ml respectivamente). La formación de miotubos se evaluó a diferentes tiempos estudiando la expresión de factores miogénicos y fibroadipogénicos mediante Western Blot, inmunofluorescencia y PCR cuantitativa. Para el análisis de la proliferación se emplearon mioblastos C2C12 cultivados con medio suplementado con suero fetal bobino (10%), en presencia o ausencia de indoxil sulfato y paracresol a concentraciones correspondientes con estadios más avanzados de la ERC (100mg/ml). La proliferación de los mioblastos se analizó estudiando el cierre de herida con el microscopio de campo claro y el ciclo celular y apoptosis mediante técnicas de citometría. RESULTADOS: Los mioblastos C2C12 tratados con toxinas urémicas mostraron una reducción significativa en el número de miotubos formados respecto a las células control, evaluados mediante la expresión de la cadena pesada de la miosina (MHC). La expresión de miogenina (MyoG), un factor involucrado en la diferenciación miogénica, fue menor en las células tratadas con las toxinas. Por el contrario, el tratamiento incrementó la expresión de los marcadores fibrogénicos TGFβ y colágeno I y adipogénicos PPARγ y FABP4. El tratamiento con dosis correspondientes a fases más avanzadas de la enfermedad produjo un descenso en la proliferación de los mioblastos en cultivo, reflejado en una velocidad más lenta de cierre de herida. El análisis del ciclo celular reveló un arresto en fase S/G2/M y el marcaje con anexina V mostró una inducción de la muerte celular por apoptosis. CONCLUSIONES: La concentración de toxinas urémicas presente en pacientes con estadio inicial de ERC reduce la formación de miotubos en el cultivo de mioblastos, alterando el proceso de diferenciación miogénica y promoviendo la expresión de marcadores fibroadipogénicos. Dosis más altas de toxinas urémicas indujeron un arresto en el ciclo celular, descenso en la proliferación y, finalmente, la inducción de muerte celular por apoptosis de los mioblastos. Estos resultados sugieren que la uremia estaría distorsionando el proceso de regeneración muscular, siendo uno de los factores que influyen en la aparición de la sarcopenia y fragilidad asociada a la ERC.