dianas 11(1) > López-Morán etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a09

Transporte de anticuerpos de dominio único a través de la barrera hematoencefálica.

Laura López-Morán^a, Eduardo Ruíz- López, Alberto Jiménez- Schuhmacher

IIS Aragón.

a. lauralopezmoran9@gmail.com; laulop22@ucm.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Anticuerpos monodominio; nanocuerpo; VNAR; barrera hematoencefálica; transcitosis; nanopartículas; péptidos de penetración celular; transportistas

Resumen

Los anticuerpos de dominio único se derivan de los anticuerpos de cadena pesada de camélidos y peces cartilaginosos. Su pequeño tamaño, especificidad antigénica, plasticidad y potencial para reconocer epítopos conformacionales únicos representan una oportunidad diagnóstica y terapéutica para muchas patologías del sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BHE) ​​plantea un desafío para su entrega en el parénquima cerebral. Por un lado numerosas enfermedades neurológicas y patologías cerebrales, incluido el cáncer, presentan alteraciones de la BHE que favorecen el paso de anticuerpos de un solo dominio en el SNC. Se ha descrito que algunos anticuerpos de un solo dominio cruzan naturalmente la BHE. Además, se pueden explotar diferentes estrategias y métodos para administrar tanto anticuerpos de dominio único en el parénquima cerebral cuando la BBB está intacta. Estos incluyen la disrupción fisicoquímica basada en dispositivos de la BHE, la transcitosis mediada por receptores y adsorción, la transferencia de genes somáticos y el uso de portadores/lanzaderas como péptidos, liposomas, vesículas extracelulares y nanopartículas. Los enfoques basados ​​en anticuerpos de un solo dominio están llegando a la clínica para otras enfermedades. Se pueden seguir varios métodos de adaptación para favorecer su transporte al SNC, evitando las limitaciones impuestas por la BHE para cumplir su potencial terapéutico, diagnóstico y teragnóstico en beneficio de los pacientes que padecen patologías del SNC.

dianas 11(1) > Bayona-Ramón-y-Cajal etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a08

Bloqueo de la comunicación intercelular mediada por ITGB3 como una estrategia terapéutica para prevenir la progresión de metástasis en pacientes con cáncer de mama metastásico.

Rocío Bayona-Ramón y Cajal, Noelia Mendoza-Calvo, Ruth González-Gómez, Marta Cano-Galietero, Elena Muro-Blanc, Stefan Hümmer, Alberto J. Schuhmacher, Santiago Ramón y Cajal

Centro de investigación biomédica de Aragón.

a. rbayonaryc@iisaragon.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: cáncer de mama; metástasis; scfv; ITGAVB3; inhibidor

Resumen

A pesar de los numerosos avances en la investigación oncológica, la letalidad de los tumores metastásicos no ha mejorado prácticamente en los últimos años. En el cáncer de mama, la progresión de la enfermedad metastásica tiene un pronóstico precario, con tasas de supervivencia a cinco años menores del 20%.
En un cribado de nuevos factores implicados en la resistencia al estrés tumoral se ha identificado la integrina beta 3 (ITGB3), además, se ha demostrado que juega un papel esencial en la comunicación intracelular a través de la captación de vesículas extracelulares (EV), parte fundamental en la progresión de las metástasis del cáncer de mama.
La identificación de los agentes moleculares implicados en la captación de las EV por parte de las células de cáncer de mama permite realizar un cribado in vitro e in vivo de inhibidores para poder identificar inhibidores selectivos que prevengan este proceso y, por tanto, puedan retrasar o impedir la progresión de las metástasis del cáncer de mama.
Entre las moléculas que interfieren con este proceso promotor de metástasis, hemos identificado y producido un scfv que según experimentos preliminares, bloquea el internamiento de EV en un porcentaje significante.

dianas 11(1) > Mendoza-Calvo etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a07

Establishment of nanobody´s selection tools to identify biomarkers in DIPG.

Noelia Mendoza-Calvo, Ruth González-Gómez, Rocío Bayona-Ramón y Cajal, Alberto Jiménez-Schuhmacher

Centro de Investigación Biomédica de Aragón (CIBA).

a. nmendoza@iisaragon.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Keywords: DIPG; Nanobody; Libraries; Diagnosis; Immuno-PET

Abstract

Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) is a highly aggressive cancer which mainly affects children between 5 and 7 years old. Tumor develops in the brainstem and its cells growth in a diffuse pattern, spreading and infiltrating through the healthy brainstem tissue, producing the affectation of vital function such as breath and heart rate. Due to its specific growth pattern, it is not possible to make a biopsy of the tumor, and therefore it will not be possible to obtain histological and molecular information. Moreover, imaging diagnosis it is also imprecise in the characterization of this malignancy. All this information is critical to obtain an accurate diagnosis of the patient, apply them the correct treatment and assess their prognosis. To perform an accurate diagnosis and molecular identification of DIPG surface biomarkers, we have generated three nanobody libraries through the immunization of three camelid with two DIPG cell lines and one with a GBM cell line. From these libraries, it is possible to isolate a given nanobody which can recognize in a highly specific way, a previously identified and characterized biomarker in the tumor cell surface. This biomarker must be exposed in the external surface of the plasma membrane. In the laboratory we have set up three different strategies to efficiently isolate a specific nanobody from one of the three libraries. Two are cell-based approaches, this means that an overexpression (OE) and a knock-out (KO) cell lines must be generated. In the first strategy KO and OE cells are attached to a cell culture plate in order to perform several rounds of negative and positive selection, respectively. The second strategy harness the sorter technology, after the negative selection in plate, the library is sorted join to the OE population. The third procedure is based on MACs technology. Obtained Nb can be used to different applications such as nano-CAR construction and immuno-PET diagnosis.

dianas 11(1) > Huertas-Lárez etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a06

Estudio de los exosomas de orina y su papel en la progresión del cáncer de próstata.

Raquel Huertas Lárez, Laura Muñoz Moreno, A Fernández Gómez, A Blasco, Irene Dolores Román, María Isabel Arenas, Angeles Sanchis Bonet, Ana María Bajo

Universidad de Alcalá. Unidad de Bioquímica y Biología Molecular. Departamento de Biología de Sistemas. Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud. Campus universitario. 28871 Alcalá de Henares (Madrid).

a. huertas.raquel.1n@gmail.com

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: cáncer de próstata; exosomas; metaloproteasas de la matriz extracelular; gamma-glutamiltransferasa; células LNCaP; diferenciación neuroendocrina.

Resumen

El cáncer de próstata (PCa) es la quinta causa de muertes en varones en todo el mundo. La gran heterogeneidad que muestra esta enfermedad en su progresión ha dificultado la descripción y estandarización de un buen biomarcador. En consecuencia, el criterio de referencia sigue siendo el estudio histológico de biopsias prostáticas, técnica asociada a un considerable error de muestreo y que conlleva importantes molestias para el paciente. Por ello, el objetivo de este estudio es analizar la expresión de las metaloproteasas de la matriz extracelular 2 y 9 (MMP-2 y MMP-9) en PCa en orina, concretamente en los exosomas aislados de esta mediante centrifugaciones seriadas y filtración. Paralelamente, se plantea estudiar el efecto de dichos exosomas sobre la línea celular de PCa dependiente de andrógenos, LNCaP. Los resultados muestran una mayor actividad gelatinolítica en exosomas procedentes de pacientes con estadios más avanzados del PCa, esencialmente debida a la MMP-9. Los exosomas aislados de orinas de pacientes con PCa inducen diferenciación neuroendocrina (NED) de las LNCaP, característica asociada a mal pronóstico y metástasis. Además, aumentan la secreción de gamma-glutamiltransferasa al medio celular. Los resultados apoyan la participación de los exosomas en la progresión tumoral debido a que transportan moléculas que median este proceso. Cabe destacar el posible uso de la MMP-9 y de la GGT como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico del PCa.

Grupo de investigación Cánceres de origen epitelial. Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) Financiación: P118/00526 cofunded by European Regional Development Fund (ERDF), 'A way to make Europe'.

dianas 11(1) > Mora-Rodríguez etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a05

TRPV1 participa en la activación de AMPK por capsaicina en las células de cáncer próstata que expresan LKB1.

José María Mora-Rodríguez, Belén G. Sánchez, Alicia Bort, Inés Díaz-Laviada

Universidad de Alcalá, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Departamento de Biología de Sistemas, Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. josem.mora@uah.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: capsaicina; AMPK; LKB1; TRPV1; PC3; LNCaP; DU-145; cáncer de próstata

Resumen

Se ha demostrado que el compuesto natural capsaicina tiene actividad antitumoral, aunque el mecanismo de acción subyacente sigue siendo desconocido. En este estudio, investigamos el mecanismo por el que la capsaicina ejerce su efecto antitumoral en las células de cáncer de próstata. En las líneas celulares que expresan LKB1, LNCaP y PC3, la capsaicina activó la quinasa activada por AMP (AMPK) y promovió la muerte celular, pero no en la línea celular DU-145 que carece de la quinasa hepática B1 (LKB1). Además, el silenciamiento de LKB1 en células LNCaP y PC3 anuló la activación de AMPK inducida por capsaicina, mientras que la sobreexpresión de LKB1 por infección lentiviral en células DU-145 indujo la fosforilación de AMPK desencadenada por capsaicina. Por otro lado, la fosforilación de LKB1 inducida por capsaicina dependía del receptor activado por potencial transitorio tipo V1 (TRPV1), ya que el silenciamiento de TRPV1 mediante infección lentiviral disminuyó la fosforilación de LKB1 y AMPK en las células que expresan LKB1. En conjunto, nuestros resultados mostraron que la capsaicina afectó a la actividad de AMPK de manera dependiente de LKB1 y TRPV1 y que puede ser una alternativa a la quimioterapia actual utilizada para los tumores de próstata.

Agradecimientos: Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III a través del proyecto PI20/01327 (Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional 'Una manera de hacer Europa') y por la Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno (Beca Patrocinio 2019-001). Parte de este trabajo se ha realizado mediante la instalación de NANOBIOSIS. Los autores agradecen a Natalia Huertas por su asistencia técnica.

dianas 11(1) > Sánchez etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a04

La retirada de andrógenos induce la reprogramación de células de cáncer de próstata a cancer stem cells.

Belén G. Sánchez, Alicia Bort, José María Mora-Rodríguez, Inés Díaz-Laviada

Universidad de Alcalá, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Departamento de Biología de Sistemas, Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.

a. belen.sanchezg@edu.uah.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: AMPK; células neuroendocrinas; cancer stem cells; pluripotencia; cáncer de próstata

Resumen

En los últimos años, la plasticidad celular ha surgido como un modo de evasión de la terapia en el cáncer de próstata. Las células tumorales, cuando se exponen a terapias anticancerígenas, pueden adoptar el fenotipo neuroendocrino que se asocia con un fracaso del tratamiento y un mal pronóstico. En este estudio, demostramos que la retirada de andrógenos a largo plazo indujo un fenotipo neuroendocrino en las células LNCaP seguido de una rediferenciación hacia “cancer stem cells”. Las células LNCaP incubadas durante 30 días en medio libre de andrógenos o con el antagonista del receptor de andrógenos 2-hidroxiflutamida desarrollaron una morfología neuroendocrina y aumentaron la expresión de los marcadores neuroendocrinos βIII-tubulina y enolasa específica de neuronas (NSE). Cuando las células se incubaron durante 90 días en un medio sin andrógenos, crecieron como esferas flotantes y mostraron una mayor expresión de los marcadores de resistencia CD133, ALDH1A1 y el transportador ABCB1A. Los factores de transcripción pluripotentes Nanog y Oct4 y el factor angiogénico VEGF estaban aumentados mientras que la expresión de E-cadherina estaba inhibida. Asimismo, la viabilidad celular reveló que esas células eran resistentes al docetaxel y a la 2-hidroxiflutamida. La retirada de andrógenos también indujo la disminución de la expresión de la quinasa activada por AMP (AMPK). Sorprendentemente, la sobreexpresión de AMPK en las cancer stem cells consiguió disminuir la expresión de los marcadores de pluripotencia y VEGF, mientras restableció los niveles de E-cadherina. Además, la sensibilidad a docetaxel se restableció en las cancer stem cells transfectadas con AMPK. Por tanto, nuestro modelo proporciona un nuevo mecanismo regulador de la plasticidad del cáncer de próstata a través de la implicación de AMPK.

Agradecimientos: Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III a través del proyecto PI20/01327 (Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional 'Una manera de hacer Europa') y por la Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno (Beca Patrocinio 2019-001). Parte de este trabajo se ha realizado mediante la instalación de NANOBIOSIS. Los autores agradecen a Natalia Huertas por su asistencia técnica.

dianas 11(1) > Díaz-Gago etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a03

Estudio del metabolismo lipídico y mitocondrial en células tumorales tiroideas deficientes en autofagia.

Sergio Díaz Gago, Javier Vicente Gutiérrez, Antonio Chiloeches Gálvez, Pablo Baquero Valls

Departamento de Biología Sistemas. Universidad de Alcalá.

a. sergio.diazgago@edu.uah.es

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Autofagia; ULK1; ATG7; Metabolismo; Cáncer de tiroides

Resumen

Resultados previos de nuestro laboratorio indican que la degradación de ácidos grasos es fundamental para la proliferación de las células tumorales tiroideas. Sin embargo, el tratamiento con inhibidores del catabolismo lipídico no disminuye significativamente la supervivencia con respecto a las células control. Por ello, en este trabajo, nos planteamos estudiar los mecanismos moleculares implicados en la reprogramación metabólica de células tumorales tiroideas. Dado que uno de los procesos intracelulares más importantes para el control del metabolismo es la autofagia, inicialmente, nos propusimos estudiar el efecto de la misma sobre el metabolismo de nuestras células. Para ello, generamos líneas celulares knockout para los genes ULK1 y ATG7 (ULK1-KO y ATG7-KO), ambos fundamentales para el correcto desarrollo y mantenimiento de la autofagia. Los resultados muestran que las células ULK1-KO y ATG7-KO presentan un descenso en la tasa de consumo de oxigeno (OCR) comparado con las células control, acompañado de una disminución en los niveles de las proteínas NDUFB8, SDHB, UQCRC2 y MTCO1, constituyentes de los complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Además, la deficiencia en autofagia provoca un aumento en la producción de lactato, indicativo de un aumento de la glucolisis. Consecuentemente, el tratamiento con el inhibidor de la glucolisis, 2-desoxiglucosa, provoca una mayor muerte celular en las células ULK1-KO y ATG7-KO que en las células control, demostrando que, la supervivencia de las células deficientes en autofagia, depende de la glucolisis. Por su parte, el inhibidor de la degradación de ácidos grasos, etomoxir, reduce considerablemente la OCR en las células control; mientras que no provoca el mismo efecto sobre las células ULK1-KO y ATG7-KO, sugiriendo que, la autofagia, está relacionada con la utilización de ácidos grasos para realizar la respiración mitocondrial. Curiosamente, los efectos del etomoxir, comparados con los de la falta de autofagia, sobre la acumulación de gotas lipídicas, son contrarios ya que; mientras que el etomoxir produce un esperado aumento de gotas lipídicas intracelulares, las células ULK1-KO y ATG7-KO presentan una disminución de las mismas frente a sus células control. Esta disminución de gotas lipídicas se explica por los resultados derivados del análisis de la lipolisis, en los que mostramos cómo, tanto la inhibición genética de la autofagia, como la inhibición farmacológica con el inhibidor lisosomal, bafilomicina A1, activan la lipasa sensible a hormonas (HSL). En conjunto, estos resultados muestras una clara relación entre la autofagia y la reprogramación metabólica de las células tumorales tiroideas.

dianas 11(1) > Vicente-Gutiérrez etal

dianas | Vol 11 Num 1 | marzo 2022 | e202203a02

Estudio de la expresión del marcador CD24 en la resistencia a la inhibición de ^V600EBRAF en cáncer de tiroides

Javier Vicente Gutiérrez, Sergio Díaz Gago, Marina Lasa Benito, Antonio Chiloeches Gálvez, Pablo Baquero Valls

Departamento de Biología Sistemas. Universidad de Alcalá.

a. javiervicentegutierrez@gmail.com

VII Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2022.
14 a 18 de marzo, 2022. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Cáncer de tiroides; V600EBRAF; CD24; vemurafenib; reprogramación metabólica

Resumen

En la actualidad, los inhibidores del mutante ^V600EBRAF son uno de los tratamientos más utilizados para tratar los carcinomas tiroideos más agresivos. Lamentablemente, la gran heterogeneidad celular de los tumores tiroideos resulta en una gran variabilidad en la respuesta terapéutica a estos inhibidores. Por ello, es necesario el estudio de las diferentes poblaciones celulares que componen el tumor, así como su respuesta a los agentes anticancerígenos utilizados frecuentemente. En este trabajo, a partir de una línea celular de carcinoma anaplásico tiroideo, hemos caracterizado una población celular con mayor resistencia al inhibidor de ^V600EBRAF, vemurafenib. Esta población se distingue por una mayor expresión del marcador de superficie CD24 y constituye el 5% de las células totales. Para poder desarrollar nuestros experimentos, realizamos una separación celular mediante citometría de flujo (“cell sorting”), hasta obtener una población celular enriquecida con un 85% de células CD24 positivas (CD24+). Nuestros resultados mostraron que las células CD24+ sobrevivían un 26,5% más, tras el tratamiento con vemurafenib, que las células control (células parentales). Además, experimentos adicionales de proliferación y apoptosis, en los que observamos que las células CD24+ proliferaban un 22% más y sufrían un 14% menos de apoptosis, tras la inhibición de ^V600EBRAF, que las células parentales, confirmaron que la población CD24+ es más resistentes al inhibidor vemurafenib. En paralelo, comparamos el perfil metabólico de ambas poblaciones celulares demostrando que, las células CD24+, producían una menor cantidad de lactato y exhibían un mayor consumo de oxígeno con respecto a las células parentales. Por último, comparamos los niveles mitocondriales de las dos poblaciones celulares analizando dos marcadores de densidad mitocondrial, TOMM20 y MTCO1, este último perteneciente al complejo IV de la cadena transportadora de electrones. Los datos obtenidos mostraron que ambos marcadores aumentaban en las células CD24+, explicando el aumento de la respiración, previamente observado, con respecto a las células parentales. Estos resultados pueden suponer una oportunidad para explorar nuevos tratamientos combinados de vemurafenib, junto con inhibidores mitocondriales, que permitan mejorar la eficacia de los inhibidores de ^V600EBRAF.