dianas 7(1) > Gallego-Tamayo etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803a22

La vía glucolítica es necesaria para la supervivencia de las células tumorales tiroideas con el oncogén ^V600EBRAF

Beatriz Gallego Tamayo^a, Eva María Jiménez Mora, Antonio Chiloeches

Departamento Biología de Sistemas, Facultad de Medicina. Universidad de Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. bgallego28@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A2 – Cáncer

Palabras clave: glucolisis; 2-Deoxyglucosa; V600EBRAF; tiroides.

Resumen

El cáncer de tiroides es el tumor endocrino más común y, aunque es altamente curativo, presenta una elevada tasa de recurrencia [1]. Una de las mutaciones más frecuentes en este tipo de tumores es la sustitución de la Valina 600 por un Glutámico (V600E) en la proteína BRAF. Esta mutación causa una hiperactivación de la vía de las ERK-MAPKs, favoreciendo la proliferación e invasividad tumoral e inhibiendo la muerte celular por apoptosis [2,3]. Sin embargo, las terapias con inhibidores de BRAF no dan los resultados esperados en el tratamiento del cáncer de tiroides, ya que, por una parte estas células crean resistencia a este tratamiento y, por otra, causan importantes efectos adversos en la piel asociadas a hiperproliferación llegando, en algunos casos, a producirse carcinomas de células escamosas y queratoacantomas en un 15-30% de los pacientes [4]. Debido a esto, se plantea la necesidad de utilizar terapias combinadas para aumentar la efectividad y especificidad del tratamiento en este tipo de cáncer. Por otra parte, las células tumorales reprograman su metabolismo energético por modificaciones en la expresión y actividad de enzimas metabólicas, para favorecer la proliferación acelerada. Por ello, el metabolismo de las células tumorales es una diana emergente para el tratamiento del cáncer, pudiendo usarse como terapia combinada con otros compuestos para aumentar la eficacia del tratamiento [5-8]. Por todo esto, estudiamos el papel que posee el metabolismo glucídico en células tumorales tiroideas que presentan la mutación ^V600EBRAF sobre la viabilidad celular y la sensibilidad al tratamiento con PLX4720, un inhibidor de ^V600EBRAF. Nosotros demostramos, en primer lugar, que la falta de glucosa o la inhibición de su metabolismo, con el compuesto 2-Deoxyglucosa, disminuye la supervivencia, determinada mediante ensayo de MTT, en la línea celular BHT101, derivada de un tumor anaplásico tiroideo. A continuación, estudiamos la relación del oncogén ^V600EBRAF con la captura de glucosa, medida con una sonda fluorescente y citometria de flujo, y la expresión de proteínas reguladoras de la via glucolítica GLUT1, HK2, LDHA y PKM2, por inmunodetección y RT-qPCR. La eliminación de la actividad y expresión de BRAF, mediante el tratamiento de las células con el inhibidor PLX4720 o tras su silenciamiento con siRNA. disminuyen la captura de glucosa por parte de las células BHT101, así como los niveles todas las proteínas estudiadas. Por último, para comprobar si la inhibición del metabolismo glucídico aumenta la sensibilidad a PLX4720, determinamos el efecto sobre la viabilidad celular del tratamiento conjunto con el inhibidor de la glucolisis 2-Deoxyglucosa y el PLX4720. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con PLX4720 junto con la inhibición de la glucolisis produce mayores efectos sobre la disminución de la viabilidad celular que cada tratamiento por separado, observándose un efecto sinérgico. Todos estos datos indican que ^V600EBRAF modula el metabolismo glucídico y que la glucolisis es necesaria para la supervivencia de las células tumorales tiroideas, por lo que podría ser utilizada como una diana terapéutica en los tumores tiroideos con la mutación ^V600EBRAF que no responden adecuadamente al tratamiento convencional con PLX4720.

1. Migzhao, Xing. 2013. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews/Cancer, 13:184-99.


2. Kam-Tsun, Tang y Chen Hsen, Lee. 2010. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma: pathogenic role and clinical implicaions. J Chin Med Assoc., 73 (3):113-128.


3. Karasarides M, Chiloeches A, Hayward R, Niculescu‐Duvaz D, Scanlon I, Friedlos F, y cols. 2004. B‐RAF is a therapeutic target in melanoma. Oncogene, 23(37): 6292‐


4. Flaherty, K., Puzanov, I., Sosman, J., Kim, K., Ribas, A., McArthur, G., et al. 2009. Phase I study of PLX4032: Proof of concept for V600EBRAF mutation as a therapeutic target. J Clin Oncol., 27.


5. Vander Heiden MG, et al. 2010. Evidence for an alternative glycolytic pathway in rapidly proliferating cells. 329: 1492–99.


6. D. Amoedo, E. Obre, R.Rossignol. 2017. Drug Discovery strategies in the field of tumor energy metabolism: limitations by metabolic flexibility and metabolic ressistance to chemotherapy. Biochim. Byophys. Acta.


7. Nissim Hay. 2016. Reprogramming glucose metabolism in cancer: can it be exploited for cancer therapy. Nature reviews. 16:635-649.


8. WangS-Y,WeiY-H,ShiehD-B,LinL-L, ChengS-P,WangP-W,et al. 2015. 2-Deoxy-DGlucose Can Complement Doxorubicin and Sorafenib to Suppress the Growth of Papillary Thyroid Carcinoma Cells. PLoSONE10(7): e0130959.doi:10.1371/journal.pone.0130959.

dianas 7(1) > Blazquez etal

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803a33

Cuerpos Apoptóticos: nuevo sistema de comunicación intercelular.

Rafael Blazquez, Coral García-Pastor, Javier Lucio-Cazaña, Ana-Belén Fernández-Martínez

1. Departamento de Biología, Universidad Autónoma de Madrid, Spain.  2. Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá, Spain.

a. rafael.blazquez@estudiante.uam.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3 – Biología y Tecnología Celular

Palabras clave: comunicación intercelular; vesículas extracelulares; cuerpos apoptóticos; prostaglandina-E2; COX-2

Resumen

Las vesículas extracelulares son vesículas membranosas producidas endógenamente en las células, que transportan complejas cargas en su interior y que se han erigido como un nuevo sistema implicado en la comunicación intercelular a través de la transmisión de señales entre células. Entre esas vesículas extracelulares, que engloba a distintas poblaciones de vesículas, se encuentran los cuerpos apoptóticos. En este trabajo hemos demostrado que los cuerpos apoptóticos procedentes de células renales HK-2 que han sido sometidas a un tratamiento con el fármaco antitumoral, cisplatino, son fagocitados por otras células HK-2 en cultivo e inducen una respuesta en las mismas. Hemos determinado que provocan una disminución de la proliferación celular, de la viabilidad celular y que desencadenan la muerte de esas células receptoras que los fagocitan. Por tanto, suponemos que la nefrotoxicidad mediada por cisplatino en las terapias contra el cáncer, puede estar amplificada por una comunicación intercelular mediada por cuerpos apoptóticos que envían señales de muerte a las células vecinas, y que potencia de este modo la señal iniciada por el cisplatino. En consecuencia, desentrañar el mecanismo de señalización subyacente a esa comunicación, la cual parece estar mediada por la prostaglandina E₂ intracelular, nos abriría un mundo de posibilidades para encontrar nuevas dianas terapéuticas con las que combatir la nefrotoxicidad por cisplatino y lograr así tratamientos de quimioterapia más efectivos y con menos efectos nocivos para los pacientes.

dianas 7(1) > López-Gutiérrez y Jiménez-Ruiz

dianas | Vol 7 Num 1 | marzo 2018 | e201803a32

Introducción del sistema CRISPR/Cas9 en Leishmania infantum

Celia López Gutiérrez, Antonio Jiménez Ruiz

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

a. celialogu@hotmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3 – Biología y Tecnología Celular

Palabras clave: Leishmania infantum; CRISPR/Cas9; SMP-4; edición génica

Resumen

El sistema procariota CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated) ha sido adaptado para desarrollar una técnica de edición genómica con gran especifidad. Este sistema consiste en un RNA guía que conduce a la proteína Cas9 a una secuencia diana dentro del genoma para generar un corte de doble cadena, provocando la deleción de genes o la introducción de “tags”. En el género de parásitos Leishmania, la complejidad de su genoma ha dificultado la implantación de otras técnicas de ingeniería génica. Sin embargo, el sistema CRISPR/Cas9 ha demostrado ser eficiente en estos organismos. En 2017, Beneke y colaboradores desarrollaron una herramienta basada en CRISPR-Cas9 que permite el “tageo” y la deleción de genes en diversas especies de tripanosomátidos sin la necesidad de llevar acabo clonaje de DNA, lo cual simplifica y agiliza el desarrollo de la técnica. Esta método consiste en la transfección de un RNA guía y un casete de resistencia a antibiótico, ambos generados por PCR. Para la introducción de esta técnica en Leishmania infantum, se usó como diana una proteína conocida como proteína miristoilada pequeña 4 (SMP-4), la cual se ancla a la membrana celular del parásito por el grupo miristoilo. De esta forma, se produjo la deleción de una de las copias del gene y, por otro lado, se fusionó al gen que codifica para la proteína “NeonGreen”, la cual permite observar la localización de la proteína en el parásito gracias a la emisión de fluorescencia.

1. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A. and Charpentier, E. 2012. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. 337(6096):816-21.


2. Lachaud, L., Bourgeois, N., Kuk, N., Morelle, C., Crobu, L., Merlin, G., Bastien, P., Pagès, M. and Sterkers, Y. 2013. Constitutive mosaic aneuploidy is a unique genetic feature widespread in the Leishmania Microbes Infect.16(1):61-6.


3. Beneke, T., R., Makin, L., Valli, J., Sunter, J. and Gluenz, E. 2017. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. R Soc Open Sci.4(5):170095.


4. Tull, D., Naderer, T., Spurck, T., Mertens, H.D., Heng, J., McFadden, G.I., Gooley, P.R., McConville, M.J., 2010. Membrane protein SMP-1 is required for normal flagellum function in Leishmania. J. Cell Sci. 123, 544–554.