dianas 8(1) > Sánchez-Baltasar etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903a11

Generación de modelos animales de tumores de mama deficientes en Rasa1.

Raquel Sánchez-Baltasar, Angustias Page, Isabel Ojeda-Pérez, Claudia Gil-Pitarch, Manuel Navarro, Ángel Ramírez

CIEMAT-Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre.

a. raquel.sanchez@externos.ciemat.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España
Sesión A1, Cáncer.

Palabras clave: Cáncer de mama, Rasa1, Tpr53, CRISPR/Cas9

Resumen

El cáncer de mama es el tipo de tumor que ocupa el primer puesto en incidencia en la población femenina mundial y es uno de los que mayor mortalidad causa. A pesar de que es frecuente encontrar mutaciones en los genes clásicos de la familia de Ras en otros tipos tumorales, no lo es en cáncer de mama, aunque la vía se encuentra frecuentemente sobreactivada en algunos subtipos como los triple negativos o basales. Estudios previos en nuestro laboratorio sugieren que esto puede deberse a la pérdida alélica de RASA1 en concomitancia con mutaciones en el gen TP53, eventos frecuentes en estos subtipos tumorales que son los más agresivos y de peor pronóstico. Por ello, hemos decidido llevar a cabo un estudio en profundidad de los mecanismos moleculares que llevan al desarrollo y/o progresión del cáncer de mama como consecuencia de la alteración de estos dos genes. En consecuencia, se planteó la generación de modelos animales deficientes en Rasa1 en combinación con mutaciones en Trp53 con el objetivo de confirmar la colaboración de la activación de la vía de Ras y p53 como causante de cáncer de mama. Para el desarrollo de estos modelos animales modificados genéticamente se empleó la tecnología CRISPR/Cas9. Para ello, se diseñó una pareja de guías específicas para el gen Rasa1 con el objetivo de utilizarlas mediante dos aproximaciones diferentes. En primer lugar, con el objetivo futuro de realizar el aloinjerto de células de glándula mamaria electroporadas con las guías diseñadas para Rasa1 (e infectadas con un vector lentiviral para la sobreexpresión de una forma mutada de p53), se realizó una puesta a punto extrayendo y purificando estas células de hembras donadoras e infectándolas con un vector lentiviral que expresa la proteína GFP para trasplantarlas en la almohadilla grasa desepitelizada de hembras receptoras. Por otro lado, se empleó la tecnología CRISPR/Cas9 para realizar la edición del gen Rasa1 en estadio embrionario. Las guías específicas para este gen se introdujeron en los zigotos junto con la Cas9 en forma de ribononucleoproteína mediante electroporación por dos métodos: iGonad (“Oviductal Nucleic Acids Delivery”) o ZEN (“Zygote Electroporation of Nucleases”). En el modelo de aloinjerto se observó una reconstitución del epitelio de la glándula mamaria con las células trasplantadas a 2 meses post-trasplante, verificando la utilidad de esta aproximación para la generación de nuestro modelo. Respecto a la electroporación de los zigotos, aunque con el método iGonad no se vio edición en ninguno de los casos, con el método ZEN se consiguió un 75% de edición, donde en más del 80% de estos animales se observó un cambio de expresión de la proteína RASA1. En conclusión, tanto la aproximación del aloinjerto en la glándula mamaria como la utilización del método ZEN para la generación de modelos animales modificados genéticamente con la tecnología CRISPR/Cas9 para el gen Rasa1, pueden ser una buena aproximación para el estudio de la implicación de este gen en el cáncer de mama.

dianas 8(1) > Peña-Asensio y Larrubia

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903a34

El tratamiento prolongado de la hepatitis B crónica eAg(-) con análogos de nucleós(t)idos junto a un nivel bajo de AgHBs se asocia a una respuesta CD8 VHB específica no agotada.

Julia Peña-Asensio, Juan Ramón Larrubia

Hospital Universitario de Guadalajara.

a. hlnd.julia@gmail.com  b. juan.larrubia@uah.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3, Mixta.

Palabras clave: Hepatitis virales; HBV; Inmunología; Inmunoterapia;

Resumen

Introducción y objetivos: La respuesta CD8 VHB específica está agotada durante la hepatitis crónica B eAg negativo (HCBe(-)). El tratamiento con análogos de nucleós(t)idos (AN) controla la replicación del VHB pero debe administrarse de forma indefinida. Sin embargo, la recuperación de una respuesta celular citotóxica VHB-específica no exhausta podría permitir la cura funcional y la suspensión del tratamiento. En este estudio, se comparó la respuesta CD8 VHB específica en pacientes con HCBe(-) tratados con AN en función de la duración del tratamiento y el nivel de HBsAg. Métodos: Se reclutaron un total de 37 pacientes HLA-A2+ con HCBe(-): 25 casos tratados durante menos de 6.5 años(<6.5a) y 12 pacientes durante más de ese tiempo (>6.5a). Se determinaron los niveles séricos de antígeno HBs (HBsAg). Mediante citometría de flujo, se visualizaron las células CD8 de sangre periférica específicas contra el epítopo HBV-Core18-27, utilizando co-tinción con complejos pentámericos, anti-CD3 y anti-CD8 (CD8+/Pent+). En las células CD8+/Pent+, se analizó: fenotipo PD-1/CD127; producción de interferón-gamma (IFNg); movilización de CD107a; capacidad de proliferación antígeno específica. Resultados: El nivel de HBsAg se correlacionó de forma negativa con la duración del tratamiento (r=-0.333; p=0.044) y fue mayor en el grupo <6.5a (3.36log UI; Rango intercuartil (RIQ) 1.2) que en el >6.5a (2.7log UI; RIQ 2.9), (p=0.023). La frecuencia de células CD8+/Pent+ sobre el total de células CD8 fue mayor en el grupo >6.5a (0.9%; RIQ 0.08) que en el grupo<6.5a (0.006%; RIQ 0.02) (p=0.001). En el grupo >6.5a se detectaron células CD8+/Pent+ en el 100% de los casos mientras que esto solo ocurrió en el 20% del grupo <6.5a (p=0.001). ). Además, en el grupo >6.5a, el nivel de HBsAg se correlacionó de manera negativa con la frecuencia de células CD8+/Pent+ (r=-0.786; p=0.036). La duración del tratamiento >6.5a y el nivel HBsAg<3.2log UI se correlacionó de manera positiva con la capacidad proliferativa de las células CD8+/Pent+ (r=0.668; p<0.001). La capacidad de degranulación de las células CD8+/Pent+ se correlacionó de manera positiva con la duración del tratamiento >6.5a y un nivel HBsAg<3.2log UI (r=0.794; p=0.006). Globalmente, el grupo >6.5a presentó una expresión de CD107a mayor (277 intensidad media de fluorescencia (IMF); RIQ 278) que el grupo <6.5a (IMF 166; RIQ 84), (p<0.05). La secreción de IFNg fue más alta en el grupo >6.5a con HBSAg<3.2log UI (111 IMF; RIQ 174) con respecto al resto de grupos (IMF 48; RIQ 52), (p<0.05). En ambos grupos del estudio las células CD8+/Pent+ expresaban un fenotipo PD-1/CD127 positivo. Conclusión: Un tratamiento con NUC superior a 6.5 años asociado a un nivel inferior a 3.2log UI de HBsAg se asocia a la presencia de una población CD8 VHB específica PD-1+/CD127+ con capacidades efectoras restauradas que podrían impactar en el desarrollo de una cura funcional.

dianas 8(1) > Errazquin etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903a33

Generación de herramientas de utilidad preclínica para el estudio del cáncer oral en pacientes con anemia de Fanconi.

Ricardo Errazquin, Carmen Segrelles, Ramón García-Escudero

CIEMAT-Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre.

a. ricardo.errazquinciudad@externos.ciemat.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3, Mixta.

Palabras clave: Anemia de Fanconi; FANCA; Carcinoma escamoso de cabeza y cuello; CRISPR/Cas9;

Resumen

La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad rara, genética recesiva, producida por mutaciones en genes de la ruta de Fanconi, implicada en reparación de ADN. La AF se caracteriza por fallo en médula ósea, malformaciones y alta incidencia de carcinomas escamosos de cabeza y cuello (CECyC). El CECyC en pacientes AF tiene mal pronóstico, y los tratamientos convencionales (quimio/radioterapia) presentan una elevada toxicidad en estos pacientes. El principal objetivo de este trabajo es generar herramientas de utilidad preclínica para obtener tratamientos efectivos y de baja toxicidad. Hemos observado que la línea de CECyC VU1365 derivada de un paciente AF con mutación en FANCA (el gen más frecuentemente alterado en AF), aunque no presenta diferencias en proliferación respecto a una versión corregida (VU1365+FANCA), si tiene una mayor capacidad de migración y una mayor sensibilidad a tratamiento con agentes genotóxicos (mitomicina-C y cisplatino). Estas diferencias pueden estar asociadas a distintos perfiles de expresión génica global, lo que permitiría la predicción de terapias efectivas mediante herramientas in silico. Por otro lado, se ha utilizado la tecnología CRISPR/Cas9 para introducir mutaciones inactivantes en FANCA en la línea celular Cal27, derivada de un CECyC de un paciente sin AF. Hemos obtenido exitosamente clones editados de Cal27 que no expresan proteína FANCA. Este resultado facilita la generación de nuevas líneas celulares de CECyC editadas para el análisis fenotípico y de expresión génica.

dianas 8(1) > Miguélez

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903a32

Aproximación al estudio de las alteraciones moleculares responsables del desarrollo del cáncer de próstata resistente a la castración.

Laura Miguélez

lmiguelez.uah@gmail.com

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3, Mixta.

Resumen

El cáncer de próstata (CP) es el segundo cáncer más frecuente en los hombres a nivel mundial. La mayoría de los tumores de próstata son dependientes de andrógenos, por lo que el principal tratamiento es la deprivación androgénica. El RA es un factor de transcripción que regula la expresión de genes implicados en la diferenciación de la próstata y en la progresión del ciclo celular. La respuesta al bloqueo hormonal es limitada y con el tiempo en un gran número de casos el tumor progresa a un fenotipo mucho más agresivo denominado CP resistente a la castración (CPRC). Entre los mecanismos moleculares implicados en este proceso está la expresión de variantes de splicing del RA (ARV7) que carecen del dominio de unión a ligando y que inducen un perfil de expresión diferente al del RA. Esto puede ser debido a que ambos interaccionan con diferentes proteínas como mecanismo para regular la expresión génica. Otro mecanismo implicado en el CRPC es la fosforilación y activación del RA por vías de transducción de señales alternativas. En este sentido, en CP se produce una disminución de la expresión de la tirosina fosfatasa SHP-1, una de las responsables de la regulación de estas vías de señalización. Por ello, el objetivo de este trabajo fue identificar las proteínas que interaccionan con SHP-1, AR y ARV7 en células de CP sensible y resistente al tratamiento hormonal. La comparación de las proteínas que interaccionan con RA, ARV7 ayudará a identificar las proteínas responsables del diferente perfil de expresión regulado por ambos receptores y las que interaccionan con SHP-1 a entender los mecanismos por lo que se activa el RA en ausencia de ligando. Para ello, hemos puesto a punto un sistema que permite identificar interacciones proteína-proteína in vivo, denominado BioID. Este método consiste en generar una proteína de fusión formada por nuestra proteína de interés y una biotina ligasa promiscua (BirA) que biotinila proteínas por proximidad. Estas construcciones las hemos generado en un vector de expresión y se han transfectado en células de CP sensibles y resistentes a los tratamientos hormonales. En una siguiente fase, se identificarán mediante espectrometría de masas las proteínas biotiniladas que son candidatas a interaccionar con nuestra proteína de interés. Los resultados obtenidos nos permitirán definir los mecanismos moleculares responsables del progreso del CP a la fase resistente al bloqueo hormonal e identificar nuevas dianas terapéuticas para esta fase del CP.

dianas 8(1) > Tosat-Bitrián etal

dianas | Vol 8 Num 1 | marzo 2019 | e201903a31

Specific biosensors in drug discovery for Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Carlota Tosat-Bitrián, Ana Martínez, Valle Palomo

Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC.

a. carlota.tosat@cib.csic.es

IV Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2019.
20-22 de marzo, 2019. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3, Mixta..

Palabras clave: quantum dots; ELA; patología molecular; célula única; TDP-43;

Resumen

Las enfermedades neurodegenerativas constituyen un problema crítico tanto médico, social como económico en todo el mundo. A pesar de los esfuerzos por comprender mejor las enfermedades neurodegenerativas, hay una falta de conocimiento sobre su patología molecular la cual es crucial para desarrollar nuevos tratamientos efectivos. La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la muerte de las motoneuronas (MN) lo cual produce una parálisis progresiva. El mecanismo subyacente a dicha muerte selectiva de las motoneuronas todavía no se ha caracterizado, convirtiéndose en una diana crucial para el desarrollo de fármacos innovadores y efectivos. La técnica de perfil molecular es una tecnología innovadora y potente para estudiar y comprender las rutas y vías de señalización que subyacen los procesos tanto patológicos como fisiológicos. Como herramienta para aplicar esta tecnología, se propone la utilización de los quantum dots (QDs). Los QD son nanopartículas formadas por un núcleo de CdSe y una cubierta de ZnS que ofrecen propiedades fotoluminiscentes únicas. Presentan una alta fotoestabilidad, altos coeficientes de extinción, amplios espectros de absorción pero estrechos de emisión lo cual permite una detección más sensible así como ensayos multiplex. Los QDs han sido conjugados eficientemente con anticuerpos monoclonales (mAB) formando sondas QD-AB que pueden utilizarse en técnicas de inmunofluroescencia implementando un inmunoensayo multiplex basado en QDs. Aplicando esta tecnología, diferentes dianas clave de la ELA como TDP-43, p-TDP-43 y CK1 pueden ser analizadas a nivel de célula única en modelos humanos como linfoblastos y células madre pluripotenciales inducidas de pacientes de ELA El propósito científico de este proyecto es contribuir aún más a comprender la patología molecular de la ELA, encontrando patrones moleculares en los pacientes, detectando así las dianas moleculares de estas enfermedades; y estudiar los cambios moleculares que se producen en las proteínas diana clave tras tratamiento farmacológico ayudando a seleccionar posibles candidatos terapéuticos.